目的基因导入受体细胞.ppt

第三节重组子的筛选,在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子。概念克隆子转化子重组子,将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子），现在这两者有通用的趋向。含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。,一、遗传表型直接筛选法,（一）根据载体选择标记初步筛选转化子在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，作为筛选转化子的依据。,一般的做法是:将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。,常用的选择标记基因主要是：抗性基因；表达产物可以发光或使反应底物显色的基因,相应的选择条件是：可以被抗性基因产物分解的抗生素；可以使基因产物发光的光线，或者是可以使基因产物显色的试剂。,选择培养基是：根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物：是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定。,（一）根据载体选择标记初步筛选转化子,（1）抗药性筛选（2）插入失活筛选法（3）插入表达筛选法（4）显色互补筛选法（5）利用报告基因筛选植物转化细胞（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞,（1）抗药性筛选,正向选择方式,若外源DNA插在BamH位点上，培养基应含Ap；若外源DNA插在Pst位点上，培养基应含Tc；利用含一种选择药物的选择培养基无法区分重组子和非重组子，只能区分转化子和非转化子。,抗药性筛选,（2）插入失活筛选法,双抗药性筛选,双,（3）插入表达筛选法,利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。有些载体在设计时，在筛选标记基因前面连接上一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记基因才能表达。,例如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其Tcr基因的上游含有一段噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。当外源DNA片段插入CI基因的Hind或Bgl位点上时，CI基因失活。Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳性重组子为Tcr表型。质粒本身因为Tcr基因受阻碍为Tcs表型，当转化细菌涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。,（4）显色互补筛选法,lacZ基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为-互补。具有完整乳糖操纵子的菌体能转译-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落成为蓝色。如果在载体DNA上组入-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ)则重组DNA分子转化lacZ互补型菌落，会在含有X-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。,lacZ是-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含lacZ的重组载体转化lacZ互补型菌株，可转译-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-硫代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落，而lacZ互补型菌株本身为白色菌落。当lacZ区插入外源基因后，再转化lacZ互补型菌株，由于不能翻译-半乳糖苷酶，转化子即使在含有Xgal和IPTG的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。此方法主要用于原核生物。,互补的检测,以显色剂x-gal作为选择物时:DNA对照组不应出现任何菌落；感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色的；感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应有白色的。其中一项不符，就有可能挑出假的转化子菌落。,（5）利用报告基因筛选植物转化细胞,报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。在植物转基因研究中，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他持殊产物的基因等。,特征作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。,新霉素磷酸转移酶基因（npt）抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。氯霉素乙酰转移酶基因（cat）也被用于筛选动植物转化子的标记基因。,-葡萄糖酸酶基因（gus）,gus的基因产物-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化4-甲基伞形花酮-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选含gus基因的转化子。由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。尤其是gus基因的3端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。,萤火虫荧光素酶基因（luc）,luc表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，Luc是一种理想的报告基因。,抗除草剂bar基因。bar基因编码磷化乙酰转移酶（PAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPT）成分的除草剂具有抗性。,冠瘿碱合成酶基因。主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因两类，存在于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA区段。冠瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染色，方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基因细胞的筛选。冠瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。,（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞,在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(Npt)基因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。常用的标记基因还有：-胸腺核苷激酶基因（tk）、-二氢叶酸还原酶基因（dhfr）-次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）-细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(ecogpt)等。,胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）等的表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞，导入含有上述基因的外源DNA，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加核苷酸的培养基中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。,二、核酸分子杂交检测法（p297）,基本原理,复性,RNA,DNA,根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同。,Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点和狭线印迹杂交菌落（或噬菌体）原位杂交,核酸分子杂交检测法分类,又称DNA印迹杂交、SouthernDNA印迹杂交,1、Southern印迹杂交,基本原理：,（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转印（5）变性解链（6）杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析,毛细管虹吸印迹法电转移印迹法真空转移法,核酸转移（印迹）方法,毛细管虹吸印迹法,利用核酸分子在电场中的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。湿式电转移干式电转移,电转移法,湿式电转移法,真空转移法,真空转移装置,硝酸纤维素膜（简称NC膜）优点：吸附能力强，杂交信号本底低缺点：DNA分子结合不牢固，膜易碎裂，依赖高盐溶液,常用的固相支持物,尼龙膜（Nylon）优点：结合单链，双链DNA的能力比NC膜强，韧性高，可重复杂交缺点：杂交信号本底高,常用的固相支持物,southern印迹杂交实验仪器,凝胶,滤膜,转移RNA至膜上,转膜,杂交、显影,2、Northern印迹杂交,两种印迹技术的比较,3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,两种方法的基本原理和操作步骤相同即通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。,斑点杂交法,狭缝式点样器,1、斑点印迹为圆形2、狭缝印迹为线状3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量,斑点及狭缝印迹杂交的特点,4、菌落（或噬菌斑）原位杂交,基本原理,直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上,溶菌、变性,DNA暴露并于滤膜原位结合,与探针杂交,三种筛选方法的比较,杂交探针指具有一定序列的核苷酸片段，它能与互补的核酸序列复性杂交，并且通过适当标记进行检测。,5、核酸杂交探针,同源或部分同源探针总cDNA探针特异性cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针,（1）核酸杂交探针的种类,理想的探针标记物应满足的条件：1)不会影响探针的主要理化性质；2)检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好；3)操作简便、省时经济实用：4)化学稳定性高、易于长期保存；5)安全、无环境污染。常用于分子杂交的探针标记物分放射性及非放射性。,（2）探针标记物,放射性标记物是指以放射性同位素对核苷酸等进行标记后的产物，常见的放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等，其中以32P、3H、35S最为常用。标记物放射性的检测主要使用盖革计数器和液体闪烁计数器等射线探测仪来完成。,放射性标记物,非放射性标记物的最大优势是无放射性污染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间保存使用，但与放射性探针相比，多数非放射性探针的敏感性及特异性较差。目前已广泛应用的非放射性标记物有：生物素(biotin)标记的核苷酸、地高辛(digoxigenin)标记的核苷酸荧光素(fluorescein)标记的核苷酸,非放射性标记物,（3）探针标记方法,探针的标记有体内标记及体外标记两种方法。体内标记法是以标记化合物作为代谢底物，通过活体生物或活细胞的体内代谢完成核酸分子标记，例如在培养基中加入3H-胸苷，就可以标记到生长在该培养基中的活细胞DNA分子上。体内标记法受多种因素的限制，且标记活性不高，一般很少使用。,体外标记,包括化学法和酶法两种。化学标记法是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种基因(如磷酸基团)发生化学反应而直接将标记物连接到探针分子上，具有简单快速、标记均匀的特点，尤其适于制备非放射性标记物的探针。酶标记法则是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，获得核酸探针。酶法应用广泛，适于制备所有放射性标记探针及部分非放射性标记探针。常用的酶法有DNA缺口平移标记法、DNA随机引物标记法、DNA末端标记法及PCR标记法等。,切口平移标记法(nickthanslationlabeling),该法标记模板链,随机引物标记法(randomprimedDNAlabeling),Klenow片段催化,该法标记模板互补链,随机引物是含有各种可能排列的寡核苷酸片段的混合物。,随机引物：46使用随机引物标记的探针一般长400-600个核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。与切口平移法不同的是，该方法标记的是模板互补链，而非模板本身。,末端标记法(DNAterminallabeling),该法标记的是线性DNA或RNA的5端或3端，属非均一性标记。1)3凸出末端的加尾标记法：末端脱氧核苷酸转移酶将带有标记的dGTP或dCTP加到DNA3-OH端2)双链DNA3隐蔽末端的填充标记：（若反应体系存在全部与模板序列互补的dNTP）以凸出序列为模板，Klenow酶或T4DNA连接酶催化补平3末端（若一种dNTP带标记则成为探针）。3)5末端标记：T4多聚核苷酸激酶将ATP的标记的-磷酸基团转移到游离的5-OH上。,PCR标记法(PCRlabeling)：标记的一种dNTP光敏标记法化学衍生结合标记法：生物素和地高辛等非放射性标记物可以与事先经过化学修饰得到的核酸衍生物更加牢固地结合，进行非放射性探针的制备。常用的化学修饰反应包括磺化、转氨、溴化等反应类型。交叉相连标记法：利用一些高分子化合物，如细胞色素c、组蛋白H1及大肠杆菌单链结合蛋白质等能与核酸结合的特性，制备相应的探针。,三、DNA序列测定法,DNA序列测定，即核酸一级结构的测定，简称DNA测序。对克隆DNA片段进行序列测定及分析:可以直观地鉴定出重组DNA分子中是否含有目的基因;可以获得目的基因的编码序列和基因调控序列.这对目的基因的表达及其功能研究具有重要意义。,DNA序列分析,目前用于测序的技术主要有:Sanger等（1975）发明的双脱氧链末端终止法Maxam和Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。,1DNA的化学降解测序法,DNA的化学降解测序法也叫Maxam-Gilbert测序法基本原理是，将待测DNA分子进行末端放射性标记，然后置于4组独立的化学反应体系中分别进行部分降解，其中每一组反应特异性地针对某一碱基或某一类碱基。通过化学降解一段时间后，在每一组反应体系中，生成各种不同长度的、一端为放射性标记固定的寡聚核苷酸分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测DNA分子的碱基序列。,（2）碱基切割反应体系,进行碱基特异性化学切割反应的试剂是硫酸二甲酯、肼（联氨）以及哌啶（六氢吡啶）。硫酸二甲酯、肼（联氨）碱基进行化学修饰；哌啶从修饰碱基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同的组合能特异地切割核苷酸序列中的特定碱基，降解待测模板DNA分子。,硫酸二甲酯（DMS）：G；pH2甲酸哌啶：G+A;肼（NH2NH2）：C+T;肼（NH2NH2）+高盐：C,1、待测模板的制备,3、待测模板DNA分子的序列分析,2、化学降解待测模板DNA分子,测序步骤,（3）DNA,序列的读取是逆电泳方向进行的,DNA,化学降解测序法不仅适于单链DNA，也适于双链DNA的测序，主要用于研究DNA的一级和二级结构、DNA甲基化位点测定和DNA-蛋白质相互作用等方面，结果准确可靠，是DNA测序的基本方法之一。它的缺点是一轮反应所能测定模板DNA长度只有250bp左右，若测定大片段DNA分子时，操作较为繁琐费时。另外，化学降解测序法不能在载体上直接进行，标记后的模板DNA分子难以纯化。,2DNA的双脱氧链终止测序法,双脱氧链终止测序法是由Sanger等在加减法的基础上建立的一种简单快速的DNA序列分析法，故也称为Sanger测序法。有时又称为引物合成法，或酶促引物合成法，因为该法是以待测DNA分子为模板，在DNA聚合酶的作用下，利用适当的DNA合成引物进行DNA互补链的合成来完成测序工作的。,基本原理：DNA聚合酶能够利用单链DNA作模板，合成出对应的DNA互补链，但在反应过程中，如果2，3-双脱氧核糖核苷三磷酸底物（ddNTP）掺入到寡核苷酸链的3端，DNA