蛋白酶活性的测定

实验四蛋白酶活性测定一、实验目的1、了解蛋白酶活性测定的原理；2、掌握蛋白酶活性测定方法。二、实验原理蛋白酶不仅能水解蛋白质中的肽键，还能水解酰胺键和酯键，所以用蛋白质或合成酰胺及酯化合物作为基质，测定蛋白酶的活性。本实验以酪蛋白作为基质，测定了肽键的微生物蛋白酶水解活性。酪蛋白在蛋白酶作用后分解为相对分子量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中添加三氯乙酸溶液，相对分子量较大的蛋白质和肽沉淀，相对分子量较小的肽和氨基酸留在溶液中，溶于三氯乙酸溶液的肽数与酶数和反应时间成正比。通过测定280nm波长下溶液吸光度的增加，可以计算出酶活性。三、实验试剂微生物蛋白酶提取物(0.01g/ml):将1.0g酶制剂加入100ml蒸馏水搅拌30分钟，在4 离心后，将上层清夜保存在冰箱中，使用前稀释一定倍数。0.02mol/L磷酸盐缓冲液(ph 7.5)；1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加入100ml0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.5)加热，完全分散后，放入冰箱保存。5%三氯乙酸(TCA)溶液。四、实验阶段1，5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37 保温。2，4个15ml插头试管，分别标记A1、A0、B1和B0。在A1和A0试管中分别吸入0.20ml酶溶液，在B1和B0试管中分别将0.40ml酶溶液成型为0.2mol/L磷酸盐缓冲液2.00ml。分别从A0和B0试管中吸入6.00ml5%三氯乙酸溶液，并将这四个试管放入37 的水浴中保温。3、在试管中吸入2.00毫升1%酪蛋白溶液，在37 保温10分钟(准确定时)，然后在A1和B1试管中吸入6.00毫升5%三氯乙酸溶液。4、将试管从水浴中去除，在室温下放置1h后，用少量的上清液浸湿滤纸后，保持滤液。5，280nm波长下，A0和B0滤液分别为空，A1和B1滤液的吸光度测定。五、计算1、在指定的实验条件下，以酶为单位定义每分钟0.001吸光度的增加。2、每克酶制剂对酶活性计算：1000/(tw)酶活性单位/酶制剂表达式中a 样品和空吸光度的差异(即A1和B1的吸光度值)；T酶作用时间(本实验10分钟)；W反应中酶的数量，g六、说明1、微生物蛋白酶粗提物在PH范围大的情况下表现出活性，但在接近中性的条件下表现出最高活性。2、微生物蛋白酶在45 以下能长时间保持稳定性。七、考试问题1、蛋白酶的种类是什么？2、影响酶活性的因素是什么？3、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题？六、数据记录和处理A1=0.279 B1=0.573酶含量0.001g/ml酶活性1=A 1000/(t w)=0.2791000/10/0.001/0.20=1.395105酶活性单位/酶制剂酶活性2=a 1000/(t w)=0.5731000/10/0.001/0.40=1.435105酶活性单位/酶制剂平均=(1.395105 1.43205)=141375酶活性单位/克酶制剂平均相对差异=(143250-139500)/141375 100%=2.65%七、考试问题1、蛋白酶的种类是什么？答：蛋白质分解酶水解蛋白质的方法：内切肽酶：蛋白质分子内部肽键，产生分子量相对小的多肽。b外部肽酶：切割蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，玻璃生产氨基酸的酶；c蛋白或多肽的水解酯结合；d蛋白质或多肽的酰胺键的水解。酶引起的来源可以分为动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶微生物蛋白酶可分为细菌蛋白酶、真菌蛋白酶、酵母蛋白酶、放线菌蛋白酶最适合蛋白酶作用的PH可分为(A)PH2.55.0的酸性蛋白酶，(B)PH9.510.5的碱性蛋白酶，(C)PH78的中性蛋白酶2、影响酶活性的因素是什么？答：酶活性以酶催化某种化学反应的速度表示。酶活性的大小，即酶含量的多少，可以表示每克酶制剂或每毫升酶制剂中含有多少酶单位，酶活性是测定酶活性的速度。酶浓度对酶活性的影响：酶反应速度与酶分子浓度成正比，在一定范围内底物分子浓度充足时，酶分子越多，底物变化越快。底物浓度对酶活性的影响：如果酶浓度为设定值，则底物的起始浓度越低，酶反应速度与底物浓度成正比。也就是说，随着气质浓度的增加而增加。所有酶和基质结合生成中间产物，然后再增加基质浓度，中间产物浓度不会增加，酶反应速度也不会增加。温度对酶活性的影响：在适当的温度范围内，酶反应速度随着温度的升高而增加，超过最佳反应温度的话，酶活性就会降低。PH对酶活性的影响：酶在最佳PH范围内表示活性，如果大于或小于最佳PH，则酶活性降低。活化剂对酶活性的影响：部分无机阳离子、阴离子、有机化合物作为活化剂，能激活酶，显示催化活性，或加强催化活性。抑制剂对酶活性的影响：酶抑制剂削弱、抑制和破坏酶活性，降低酶反应速度。3、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题？答：使用的盘子要干净，注意配对。手指要拿走玻璃棉的两侧，盛的样品量必须是2/