肿瘤的诱导分化和凋亡疗法.ppt

第十六章肿瘤的诱导分化和凋亡疗法,受精卵的全能性,人体细胞总数：1014类型：200多种,细胞可以通过增殖来增加数目，那么细胞通过什么方法来改变其结构和功能呢？,细胞分化（Differentiation),由同源细胞逐渐变为在形态结构、生理功能和生化特征等方面具有稳定差异的另一类型细胞的过程。,干细胞,干细胞(stemcells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞,分化异常与肿瘤干细胞,传统观念认为,肿瘤是由体细胞突变而成,每个肿瘤细胞都可以无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象肿瘤干细胞：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。,Selfrenewalanddifferentiationarerandom.Allcellshaveequalbutlowprobabilityofextensiveproliferation.Onlycellswithselfrenewalcapacitycansustaintumorgrowth.,Distinctclassesofcellsexistwithinatumor.Onlyasmalldefinablesubset,thecancerstemcellscaninitiatetumorgrowth.,TwoGeneralModelsforCancerHeterogeneity异质性,1.Allcancercellsarepotentialcancerstemcellsbuthavealowprobabilityofproliferationinclonogenicassays（随机模式）2.Onlyasmalldefinablesubsetofcancercellsarecancerstemcellsthathavetheabilitytoproliferateindefinitely.（干细胞模式）,OriginoftheTheoryofCancerStemCells,OnlyasmallsubsetofcancercellsiscapableofextensiveproliferationLiquidTumorsInvitrocolonyformingassays:-1in10,000to1in100mousemyelomacellsobtainedfromascitesawayfromnormalhematopoieticcellswereabletoformcoloniesInvivotransplantationassays:-Only1-4%oftransplantedleukaemiccellscouldformspleencoloniesSolidTumors-Alargenumberofcellsarerequiredtogrowtumorsinxenograftmodels-1in1,000to1in5,000lungcancer,neuroblastomacells,ovariancancercells,orbreastcancercellscanformcoloniesinsoftagarorinvivo,TherapeuticimplicationsofCancerStemCells,Mosttherapiesfailtoconsiderthedifferenceindrugsensitivitiesofcancerstemcellscomparedtotheirnon-tumorigenicprogeny.Mosttherapiestargetrapidlyproliferatingnon-tumorigeniccellsandsparetherelativelyquiescentcancerstemcells.,第一节诱导分化与肿瘤治疗,肿瘤细胞在一定条件和诱导分化剂的作用下可以向正常细胞转化,Wnt,Shh,andNotchpathwayshavebeenshowntocontributetotheself-renewalofstemcellsand/orprogenitorsinavarietyoforgans,includingthehaematopoieticandnervoussystems.Whendysregulated,thesepathwayscancontributetooncogenesis.Mutationsofthesepathwayshavebeenassociatedwithanumberofhumantumours,includingcoloncarcinomaandepidermaltumours(Wnt),medulloblastomaandbasalcellcarcinoma(Shh),andT-cellleukaemias(Notch).,Pathwaysinvolvedinself-renewalthatarederegulatedincancercells,诱导分化剂,1.极性化合物:包括二甲亚砜(DMSO)2.佛波酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13acetate，TPA)。3.维生素D3及其衍生物4.cAMP及其衍生物5.细胞因子:包括G-CSF、GM-CSF、IFN、TGF-、TNF、6.芳香族脂肪酸:包括桂皮酸、苯丁酸、苯乙酸及其衍生物等。7.抗肿瘤药物:包括MTX、DDP、Ara-c、三尖杉酯碱、抗肿瘤抗生素、地塞米松等。8.中药提取物及复合制剂:包括姜黄素、人参总皂甙。9.维A类化合物:10.其它类:包括5-氮杂-2-脱氧胞核苷(ADC)、蛋白磷酸化剂(银毛酸)、星形孢菌素、乳香酸、三氧化二砷等。,全反式维甲酸All-trans-retinoicacid,全反式维甲酸(ATRA)，也叫做维A酸。其抗肿瘤作用的证实被誉为九十年代国际抗癌药物的三大发现之一，具有很强的诱导分化肿瘤细胞作用，备受国际国内医药界的关注，是目前国内治疗急性早幼粒细胞白血病、骨髓异常增生（白血病前期）尤其是早幼粒细胞白血病的临床首选药物。,ATRA联合三氧化二砷治疗APL,位于15号染色体上的早幼粒白血病基因与17号染色体上的维甲酸受体基因易位，形成特定的融合基因，导致急性早幼粒细胞白血病,Thisschematicpresentationofthetranslocation(15;17)(q22;q12),characteristicofAPL(M3),involvesthegenesPML-RAR-alpha,维甲酸和砷剂通过不同的途径，靶向作用于该型白血病的同一关键致病基因编码的蛋白质。因此提出两药共用的协同靶向治疗设想,思考题,细胞分化、肿瘤细胞分化特点干细胞、肿瘤干细胞诱导分化剂,第三节诱导凋亡与肿瘤治疗,1972年KerrApoptosis(凋亡)编程性细胞死亡(programmedcelldeath，PCD)细胞凋亡是形态学概念，编程性细胞死亡大多表现为细胞凋亡，但并非所有编程死亡的细胞都有细胞凋亡的形态特征,NormalwhitebloodcellApoptoticwhitebloodcell,Duringapoptosis(programmedcelldeath)cellsblebandeventuallybreakapartwithoutreleasingcontents.,Apoptosisduringthemetamorphosisofatadpoleintoafrog.Thecellsinthetadpoletailareinducedtoundergoapoptosisstimulatedbytheincreasesinthyroidhormonethatoccursduringmetamorphosis,C.elegans是研究PCD的理想材料（生命周期短，细胞数量少）。1030cellsgeneratedbut131cellsdie,Typesofcellsthatundergoapoptosis,Apoptosisintheembryonicmousepaw.Apoptosisoccursbetween12.5to14.5daysinembryogenesis,Apoptosisandnormalmorphogenesis.TUNELassay(immunodetection)detectsbreaksinDNAascellsundergoapoptosis,+1day,Apoptosisisalsoimportantinthedevelopmentofthenervoussystem,2002年10月7日英国人Sydney、美国人Horvitz和英国人Sulston，因在PCD方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。,H.RobertHorvitz,JohnE.Sulston,SydneyBrenner,细胞凋亡与细胞坏死的区别特征细胞凋亡细胞坏死诱导因素生理及弱刺激强烈刺激膜完整性保持到晚期早期即丧失细胞体积减少、固缩增大肿胀染色质凝聚成半月形稀疏成网状细胞器无明显变化肿张破坏溶酶体保持完整破坏外溢细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片基因组DNA有控降解随机降解大分子合成一般需要不需要基因调控有无受累范围单个细胞丢失成群细胞死亡后果不引起炎症反应引起炎症反应意义生理死亡方式病理死亡方式,诱因,形态,分子水平,转归,www.roche-applied-,NATURE|VOL405|4MAY2000|,STAGESOFAPOPTOSIS,Shermanetal.,1997,一.凋亡相关基因及端粒酶,bcl-2家族p53基因C-myc基因Fas/Fas-L系统Caspase(半胱天冬蛋白酶)家族端粒和端粒酶,Apoptosis:Pathways,DeathLigands,DNAdamageHO,Hoechst33258;DAPI。（3）电子显微镜观察,NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess（488nm400）,电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。,2、生物化学检测,（1）磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）（2）线粒体膜势能的检测JC-1（3）DNA片断化检测DNALadder测定DNA含量分析（4）TUNEL法,（1）磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）,磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。,磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）,AnnexinV-FITCFluorescence,PIFluorescence,（2）线粒体膜势能（mt）,线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、JC-1、TMRM等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。,MitochondrialstainingwithJC-1Thedyeundergoesareversiblechangeinfluorescenceemissionfromgreentoredasmitochondrialmembranepotentialincreases.Cellswithhighmembranepotentialpromotetheformationofdyeaggregates,whichfluorescered;cellswithlowpotentialwillcontainmonomericJC-1andfluorescegreen.Therefore,thered/greenratiocanhelptoidentifyacellsstatus.themitochondriastainedwithJC-1inanormalcell(leftpanel)andthemitochondrialpotentialcollapseinducedbyhydrogenperoxideinNIH-3T3cells(A:Basalstate;B:AfterHydrogenPeroxide).,（3）DNA片断化检测,(DNAladder)：染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱,DNA含量分析,SubG1accumulation,（4）TUNEL,DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（Terminaldeo