超高效液相色谱法测定鸡组织中二硝托胺及其代谢产物残留量

超高效液相色谱法测定鸡组织中二苯胺及其代谢产物残留吴银良皇甫伟小姐相当宁波农业科学研究所，宁波315040)要点：建立了用超性能液相色谱法同时测定鸡组织中二硝基硫胺和代谢产物(3-氨基-5-邻-酰亚胺，anot)的方法。样品用酸性磷酸盐缓冲液两次萃取，离心后结合萃取物调整为pH7.0，HLB固相萃取小柱，溶出0.1%甲酸溶液-乙腈(80: 20，v/v)，洗脱液滤膜后超性能液相色谱分析，二极管阵列检测仪尼发托敏和ANOT的检测限制分别为25和55ug/kg。在附加浓度15009000ug/kg的范围内，dinitrotamine和ANOT的平均附加回收率为79.2%88.1%，部署中的相对标准差(RSD)为2.7%5.2%，部署之间的RSD为4.1%峰值面积在样例浓度和202000ug/L范围内具有良好的线性关系，并且dinitramine和ANOT的线性回归系数均大于0.9998。关键词鸡组织；超高速液相色谱；二尼托胺；代谢产物引言1二苯胺(Dinitolmide)是1960年法国Dow公司开发的二苯二胺抗球虫剂1。1989年，我国批准了生产和使用，二硝胺毒性小，预防球虫病效果好，使用广泛，但长期使用高浓度会产生药物残留，潜在危害人体健康。我国农业部235号公告中，二苯胺的最大残留限量是亲体和代谢产物(3-amino-5-nitro-o-toluamide，anot)总量表，鸡肉和鸡肉之间的量分别为3000和6000ug/kg目前还缺乏相应的残留分析标准法，因此，需要对鸡组织中二聚氰胺和ANOT残留的测定方法进行研究。饲料和动物组织双氰胺和ANOT的残留量分析方法主要是薄层色谱3和高效液相色谱4-7，但大多数方法分析对象只是亲体或代谢产物。陈慧华等用HPLC-MS方法在动物组织中检测出22种同化激素8。但是在动物组织中，二尼托胺的分析方法只有SN/T 2453-20109，分析对象只是二尼托胺，没有其代谢产物ANOT的分析方法。本研究根据尼泊托敏和ANOT的化学性质，建立了缓冲溶液萃取-固相萃取净化相结合的预处理阶段，采用超高性能液相色谱分析，具有高灵敏度、准确性和稳定性。2实验部分2.1仪器和试剂配备水超性能液相色谱、二极管阵列检测器；Acquity BHE C18列(100 mm2.1 mm，1.7um)；固相萃取器(美国Supelco公司)；HLB小支柱(3 mL、60 mg、Waters公司)；西格玛离心机；Ultra-Tyrrax T25英寸均质机(德国)。尼佩托胺和ANOT标准产品(Ehrenstorfer公司)；甲醇和乙腈(色谱纯，默克公司)；甲酸(色谱纯，Tedia公司)；KH2PO4和k2 hpo 43号2(分离纯，上海化学试剂公司)；磷酸盐缓冲液(pH6.0和4.0)。2.2色谱分离条件移动相：A为0.1%甲酸，b为乙腈。拔模洗脱：0-1.0分钟，80% a；1.0-4.0 min，80%-30% A；4.0-5.0 min，30% a；5.0-5.1 min，30%-80% a；5.1-7.0 min，80% a .流速0.2 mL/min，注入量10uL，检测波长317nm；柱温度30。2.3试样状态在50mL离心管中经过2 g测试，在鸡和鸡之间分别以pH 7.0和pH 4.0的磷酸盐缓冲液10mL，10000 r/min的速度平均1 min，以8000 r/min离心5 min的速度提取上清液。在残留物中添加10毫升磷酸盐缓冲液，在同一步骤操作后合并上等液。4 mL上清液为pH 7.0，用8000 r/min离心5分钟后，在3 mL甲醇和3 mL水激活的HLB柱上添加上清液，净化液面接触柱吸附层表面时3 mL水浸出，柱萃取，4 mL0.1%甲酸-乙腈(80: 20)2.4线性实验准确地说，尼泊托明和ANOT标准品分别将10.0毫克放在100毫升容量的瓶子里，用乙腈定容量，获得了100毫克/L的标准储备溶液。从100毫升容量瓶中正确吸收10毫升标准储备溶液、乙腈量，得到10毫克/L混合标准中间操作溶液。用0.1%甲酸-乙腈(80: 20，v/v)稀释，制备20，100，200，500，1000和2000 mg/L系列标准工作液，进行LC分析，3次注入每个浓度，对标准溶液的浓度进行添加2.5回收率实验2.3节等回收率添加实验样品处理，鸡肉添加浓度为1500，3000和4500mg/kg；鸡肝添加3000，6000和9000 mg/kg。3结果和讨论3.1色谱条件的建立5-羟色胺和ANOT的标准溶液在210-800 nm范围内扫描(图1)，尼发胺各有2个最大吸收峰，分别为216.0和300.8 nm。ANOT至少有两个317.4和526.9 nm的最大吸收峰。考虑到ANOT的灵敏度低于dinitrotamine，该实验选择317 nm进行分析，以最大限度地提高ANOT的灵敏度，避免峰值。拔模洗脱同时分析二硝基胺和二硝基胺，如果初始流动相中有机相的比例大于25%，则二硝基胺和二硝基胺排出得太快，易受杂质干扰。有机相比低于15%时，ANOT容易受到杂质的干扰，因为峰值较晚。本实验确定了初期流动奖中获奖奖和有机奖的比例为833362。如图2所示，dinitomin和ANOT的峰值形式在空白组织中没有干扰现象。3.2萃取净化条件的选择地尼托明和ANOT极性强，容易溶解在酸性溶液中，使用磷酸盐缓冲液pH(4，5，6，7)提取鸡肌肉和鸡肝脏样品(图3)。当PH=6.0时，肌肉样品中二硝胺和ANOT的提取回收率超过90%。对于肝脏样品，pH=4.0-7.0的提取效果越来越差，仅在pH 4.0中，dinitramide和ANOT的提取回收率高于90%。因此，在采样时，肌肉和肝脏样本分别使用pH 6.0和pH 4.0的磷酸盐缓冲液。实验表明，直接固相萃取净化鸡肉提取物时，ANOT的回收率约为40%。用邦德Elut C18柱更换HLB柱后，回收率没有明显改善。鸡提取物调节到pH 7.0后，经过HLB柱，回收率超过90%。邦德El ut C18柱，回收率没有明显改善。这个实验使用HLB柱进行净化。3.3线性实验实验结果尼费托敏和ANOT在20-2000 ug/L浓度范围内以峰值面积与浓度(mg/L)绘制，结果标准曲线方程式分别为y=206.6x-1049.7(ANOT)和y=211.5 x-1113.4方法检测限制、回收率和精度用空样品添加标准溶液的方法，对鸡和鸡之间的样品进行了3次追加回收实验，每个浓度点重复6次，结果见表1。鸡肉和鸡肉之间的浓度点双氰胺和ANOT的平均额外回收率在79.2% -88.1%之间。布局中的相对标准偏差(RSD)介于2.7%到5.2%之间，布局之间的RSD介于4.1%到6.9%之间，准确度和稳定性都很好。信噪比s/n=3: 1计算为两个组织中55.0 ug/kg (ANOT)和25.0 ug/kg(nepeto Amin)的检测限制。参考文献：1.田婴，刘子生(田婴，刘在胜)。辽宁畜牧兽医lioning journal of animal husbandry and vetineriy medicine，1996，633369021-222.2002年农林部235号公告，the Ministry of agriculture bulletin of PRC 2353.Webster GK、pastor erj、hawkinsk a、horschal.j. agric.food chem。1998，463336363623至36294.morawskij，Kyle g.j. aoac int，1984，67 (5) :11至8625.parks o w，doerrr c.j. aoac int。1986，69 (1) 333670至716.burns I w，Jones a D. analyst，1980，105 (1250) :59至5127.Shao Yao-don，Lin dong(临东，临东)。Progress in Veterinary Medicine(动物医学进展)，2009，30(5): 55-578.农业部第783号公告-5-2006，determination of dinitol mide in feeds high performance liquid chromatography(饲料中二胺的测定高效液相色谱)national standard of the people s Republic of China(中华人民共和国国家标准)9.SN/T2453-2010，Determination of zo