抗生素药物的分析

抗生素药物的分析,第一节 概 述,概念：具有抑制或杀灭微生物的一类物质,抗生素药物,特征： 生物体在生命活动过程中合成的次级代谢产物。 性质不稳定，易降解、聚合 纯度一般较低 临床上会引起不良反应 临床应用广泛，影响大 p159,生物学法和化学及物理化学法,生物学方法：是以抗生素对细菌的效应（抑制细菌生长或杀菌力）作为衡量效价的标准。 优点：更能够确定抗生素的医疗价值。 缺点：操作步骤多、测定时间长。化学及物理化学法：是利用其特有的化学和物理化学性质及反应而进行测定。 优点：适用于化学结构确定的抗生素，迅速、准确、专属性强。 缺点：杂质往往有相同的结构。,第四节 抗生素效价微生物检定法,一、微生物检定法定义： 是利用微生物发育时对某些物质的特殊依赖性，按这些物质对微生物生长的影响，对他们作出定量检定的方法。 微生物检定法可分为三类：,P194 dilute method turbid compare method diffuse method,比浊法,琼脂扩散法,稀释法,第四节 抗生素效价微生物检定法,一、微生物检定法定义： 是利用微生物发育时对某些物质的特殊依赖性，按这些物质对微生物生长的影响，对他们作出定量检定的方法。 微生物检定法可分为三类：,P194 dilute method turbid compare method diffuse method,比浊法,琼脂扩散法,稀释法,与化学方法相比:,二、抗生素标准效价（potency)单位,牛津单位:抑制50毫升肉汤培养基中金黄色葡萄球菌生长的青霉素的最低含量为一个牛津单位.一个牛津单位相当于0.6ug的青霉素钠盐所具有的抗生活力，1mg青霉素G钠盐含有1667个牛津单位,(IU)（一）稀释单位 (u/ml，u/mg)将1mg抗生素配成溶液，在一定条件下进行稀释，对某一细菌能抑制其生长的最高稀释度，即为1mg抗生素中可含有的单位。,P159,（二）重量单位 (u/mg) 以抗生物有效成分（即生理活性部分）的重量作为抗生素的单位,称重量单位。如一个链霉素碱单位的重量为1微克，一个青霉素G钠盐单位的重量为0.6微克。同一种抗生素的各种盐的效价可根据其分子量与标准盐类进行换算而得。,青霉素G钾盐的理论效价（U/mg）=,（U/mg）,1类似重量单位: 以抗生素盐类纯品的重量为单位。包括无生物活性的酸根和金属离子。2重量折算单位 以与原始的生物活性相当的纯抗生素实际重量为一个单位。3特定单位 以特定抗生素某一批产品的某一重量为一个单位，经有关国家权威机构认可而定.,效价测定的方法：一、稀释法（dilute method）二、比浊法 （turbid compare method）三、琼脂扩散法（diffuse method）,一、稀释法,原理：用液体培养基逐级将抗生素稀释，在各管中加入等量的试验菌液，进行培养，观察抑制细菌生长的最低抗生素浓度，再与同法测定的标准品终点作比较，从而求得被测抗生素的效价。,X=(T/S)*CX样品效价(U/ml)T检品液最大稀释倍数S标准品液最大稀释倍数C标准品液效价(U/ml),-：细菌被抑制 +：细菌生长,X=(T/S)*C=（16/32）*40=20 （U/ml),检测终点判断：1、试验菌生长完全抑制2、生长50%抑制3、指示剂变色4、电位差的改变5、菌种的溶血现象等,二、比浊法,原理：将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养基内，混匀后，经短期培养（约3-4h），测量培养基浊度，其浊度与细菌数、细菌群体质量存在直接关系，在一定的范围内符合比耳定律。 细菌数、细菌群体质量又直接受抗生素效价的影响。,操作流程如图：,影响因素：,一、影响比浊法的物理因素 1、散射现象 2、菌液浓度： 3、细菌体大小的变化二、培养基：成分、酸度、培养温度、通气等条件影响。金黄色葡萄球菌，pH在6.8-7.8。三、培养：温度、振摇。,基本要点：1 培养条件的控制：试管规格均一 水浴箱水温均匀，试管按拉丁方排列。2 细菌生长误差的控制：3 测量时间的控制：各管应先充分混匀，将菌液移入比色皿后静止2分钟后测定。,三、琼脂扩散法（diffuse method） 即管碟法,管碟法原理: 抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散，形成一定浓度抗生素的球型区，抑制试验菌生长，通过透明培养基观察抑菌圈，抗生素剂量的对数与抑菌圈面积或直径成正比。在同样条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应(抑菌圈)进行比较； 当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液对一定试验菌所得的剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。 根据以上原理，可设计为一剂量法、二剂量法及三剂量法。从而可以较为准确地测定供试品的效价。,P196,抑菌圈的形成,P197,（1）D的影响因素： 抗生素本身结构、分子量等 杂质： 琼脂含量： 菌种对抗生素的吸附作用： pH影响分子的形式、 温度影响扩散 D增大，r也增大,影响抑菌圈半径的因素：,（2）T的影响： 一般T增加，r增大。（3）M的影响：在一定的范围内，小管内M越大，抑菌圈直径越大。（4）C的影响：C越小，抑菌圈直径越大（5）H的影响：培养基增厚，则抑菌圈减小。,操作中要注意：,1试验菌种：挑选合适的敏感菌；用适宜的菌种保存方法；定期对菌种分离纯化；控制菌龄菌量。2培养基：培养基的成分影响抑菌圈的大小和清晰度，pH。,一剂量法（标准曲线法）,一剂量法（标准曲线法）原理：在一定范围内，抑菌圈的直径随抗生素浓度的增减而增减。抑菌圈的直径与抗生素的对数剂量成线性关系，据此测定抗生素效价。,Y=a+bXY:抑菌圈直径A：截距B：斜率X：抗生素浓度的对数。,方法：为了消除平板间的差异，在每一平板的含菌培养基上放置6个小钢管，相间的3个小管内加入抗生素标准品的某一浓度（Ck）, 产生的抑菌圈直径平均值为 .另外3个小管内加入标准品的中心浓度（Co）,所产生的抑菌圈直径平均值为 。 令fk = f= a+bX标准曲线的制备：做8个浓度，取24个平皿，分8组，每组3个取平均值。fk对X作图。,-,一剂量法,令:fk 与抗生素对数剂量成正比标准品： 8个剂量，每个3只平皿样品：至少3只平皿,一剂量法标准曲线示意图X 轴 fkY 轴 抗生素的对数剂量,二剂量法,将抗生素的标准品及检品各稀释成有一定比例的二种剂量（2：1或4：1），即高剂量和低剂量，在同一平板上进行对比，根据所产生抑菌圈大小来计算检品效价的方法。效价计算公式：抗生素浓度的对数与抑菌圈直径呈直线函数关系。根据二直线间抗生素对数剂量之差，可求得检品的效价。,二剂量法,V: (UH-SH+UL-SL)/2W:(UH-UL+SH-SL)/2 I: log(H/L): 效价log =IV/W,P200,效价计算公式：已知抗生素浓度的对数与抑菌圈直径呈直线函数关系。由于标准品与检品的性质相同，则二者的直线斜率应相等。在浓度相同时，两直线重合，而在浓度有差距是，二直线应该互相平行。,SH:为抗生素标准品高剂量（dS2）所致的抑菌圈直径SL：为抗生素标准品低剂量(dS1)所致的抑菌圈直径UH：为抗生素检品高剂量(dT2)所致的抑菌圈直径UL：为抗生素检品低剂量(dT1)所致的抑菌圈直径,假设,K: 高剂量/低剂量（2/1 或4/1）,图示的检品与标准品二线间对数剂量之差,如果二线完全平行，则S应与UH SH、UL SL相等。实际上，二线不一定完全平行，故应求平均值：,则：,则：,（1）,（2）,将（2）代入（1）：,再乘以标准品与检品的剂量比(D),通常为1，得二剂量法的效价计算公式：,P203,举例：某批青霉素效价测定，标准品S2、S1为1.0 U/ml、0.5 U/ml；供试品T2、T1浓度大约与标准溶液相当，试验菌种：金黄色葡萄球菌（26003），试验结果如下表：,要求：1、高剂量抑菌圈直径应为2024mm，个别可为1824mm，高剂量与低剂量抑菌圈直径之差应大于或等于2mm。2、底层琼脂20ml，上层5ml，每一检品所用平板不少于4个。3、等距安置小钢管4个，相对角为同一物质。4、 为10010%（更精确要求1005%）5、标准品与检品同质,V:(U3+U2+U1-S3-S2-S1)/3W:(U3-U1+S3-S1)/4K:剂量间比值(1:0.8)I: logk:效价log=IV/W,三剂量法：即应用高、中、低三种剂量，在同一实验条件下比较标准品及检品溶液的抑菌圈大小，以求得检品效价的方法,要求：1、标准品中剂量抑菌圈直径1518mm2、高、中、低剂距为1:0.83、每一检品不得少于6个平皿4、每板上等距安放小钢管6个5、: 10010%（100%5%）,影响抗生素效价管碟法测定结果的因素,（一）影响抑菌圈形状的因素与控制 1稀释抗生素用的缓冲液的pH值、盐浓度的影响 . pH值低或含盐浓度高，就会不显抑菌圈或呈卵圆形抑菌圈。这是因为抗生素溶液的盐浓度高或pH值过低，可能改变抗生素分子的解离状态，影响了抗生素对试验菌抑制作用。 2制各琼脂培养基菌层，加菌时培养基温度的影响 3测试用的器材洗净度的影响 4. 双碟培养温度的影响 5. 其他操作的影响,（二）影响抑菌圈边缘清晰度的因素与控制 1 试验菌长时间放置、菌量 2 培养基的原材料品种与质量，生测用培养基的原材料的选择很重要。 3调节培养基的pH值或增加适量的盐浓度可使抑菌圈清晰. 4不适当延长双碟的培养时间，使抑菌圈边缘不清。,抗生素效价管碟法测定的操作技术,操作分为八步：1 试验菌的纯化与悬液的制备2 缓冲液、灭菌水与培养基的制备3 标准品、供试品的称量、溶解与稀释4 双碟的制备及放管5 滴加药液6 恒温培养7 测量抑菌圈直径或面积8 计算操作流程：,四、比浊法与管碟法比较,第四节 抗生素效价微生物检定法,一、稀释法 二、比浊法 三、琼脂扩散法 管碟法原理及操作步骤： 影响抑菌圈半径的因素：,三、琼脂扩散法,一剂量法（标准曲线法）二剂量法三剂量法,第五节 生物统计法在抗生素效价检定中的应用,以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试品与相当的标准品或对照品在一定条件下比较其产生特定生物反应的剂量间比例，从而测定供试品的生物活性。同时进行试验可靠性测验，可信限计算等统计分析。,第五节 生物统计法在抗生素效价检定中的应用,以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试品与相当的标准品或对照品在一定条件下比较其产生特定生物反应的剂量间比例，从而测定供试品的生物活性。同时进行试验可靠性测验，可信限计算等统计分析。,量反应平行线测定实验设计类型,1.随机设计；不同剂量所致变异2.随机区组设计 各剂量的区组数（m，碟数）相等，因此在安排时要使每个区组的容量（K，剂量数和）相等。抗生素效价测定（管碟法）采用随机区组设计。,可靠性测验目的,抗生素效价测定属于量反应平行线测定计算原理是以S和T的对数剂量与反应呈直线关系以及S和T两条直线平行为基础。,可靠性测验方法,抗生素效价测定中，存在有S和T的差别，直线及平行线关系，剂量间和双碟间的关系。通过统计以上各组均数间的方差，以试品间、回归、剂间（列）、碟间（行）的方差与误差项（S2）的比值（称F值），来确定各自差异的显著性程度和实验结果的可靠性。F值（F值=该项方差/误差项S2）可作为观察实验显著性程度的一个指标。,可靠性测验结果分析,（1）试品间（F1）：本项是用以观察S和T的结果是否是显著差别。（2）回归（F2）：当P0.05）。归纳如下：试品间差异不显著（P0.05）回归项非常显著（P0.05）剂间差异显著（P0.05）。,四环素片效价测定（2.2）法,S：国家标准品稀释液浓度：ds2=40u/ml；ds1=20u/mlT：供试品，标示量25万u/片，按标示量配制稀释液。稀释液浓度：dT2=40u/ml；dT1=20u/mlr（剂距）=21I=logr=log2=0.30103y（反应值）=抑菌圈直径,M 碟数 k 剂量数和,自由度,试品间差异不显著（P0.05）回归项非常显著（P0.05）剂间差异显著（P0.05）F=方差/S2 变异性自由度/误差项自由度,效价计算,可信限（FL）,第二节 抗生素类药物的鉴别,鉴别杂质含量,-内酰胺类,利福霉素类,氨基糖苷类,四环类,多肽类,大环内酯类,一、-内酰胺类抗生素的鉴别,分类：青霉烷类（四氢噻唑五元环），头孢烯类（二氢噻嗪），碳青霉烯类（硫霉素），克拉维酸（五元环中的硫被氧代替，且六位没取代基）。结构的共同点： 1、和内酰胺相邻的碳原子上有一羧基。 2、内酰胺中氮原子相对的碳原子上有一功能团氨基。,P162,青霉素有三个手性碳，头孢有两个手性碳，有旋光性。 青霉素G及头孢有紫外吸收。青霉素在酸碱或青霉素酶的作用下均会发生降解。头孢类相对稳定。,鉴别： 1、酶法： -内酰胺酶2、红外吸收光谱法：3000-2800(C-H),3350cm-1(N-H),1800-1600(羰基)，1460-1375（甲基或次甲基）3、紫外吸收光谱法4、茚三酮反应：是氨基的反应，与茚三酮缩合， 生成蓝紫色化合物 5、与斐林试剂反应 类似肽键（-CONH-）结构，可产生双缩脲反应。开环分解使碱性酒石酸铜盐还原显紫色。6、色谱法：薄层色谱后，氯铂酸与硫醚基反应是灵敏度高的显色试剂,含量测定药典收载方法，如HPLC、碘量法、汞量法、酸碱滴定法、紫外可见分光光度法等,含量测定 HPLC,色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以有关物质项下流动相A-流动相B（7030）为流动相，检测波长为225nm；测定法 取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取青霉素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，其结果乘以1.0658，即为供试品中C16H17N2NaO4S的含量。,其他检查：青霉素聚合物:,二、氨基糖苷类抗生素环己醇配基以糖苷键与氨基糖相连。链霉素，布鲁霉素，卡那霉素，庆大霉素，新霉素。,（一）鉴别1、茚三酮反应：蓝紫色化合物2、坂口反应（sagaguchi test)：链霉素水解产物链霉胍特有。链霉胍，8-羟喹啉分别与次溴酸钠反应，其各自的产物在相互作用生成橙红色化合物。,3、糖类反应：莫利西反应(Molisch test)，五碳糖或六碳糖在硫酸存在的条件下脱水成羟甲基糠醛，与蒽酮显蓝色，与-奈酚呈红紫色。,4、埃尔松-摩根（Elson-Morgan test)：样品在强酸或强碱水解后释放出氨基己糖，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，形成吡咯的衍生物，在碱性条件下与对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液（Ehrlich试剂）成红色，在540nm处可定量测定。,5、麦芽酚反应(maltol test)： 水解、重排 Fe3+链霉素 麦芽酚 紫红色络合物 OH- H+,（二）含量测定（微生物法）,三、四环类抗生素定义：含有氢化四骈苯的具有抗菌活性的一类化合物。作用机理为阻止蛋白质的合成和肽链的延伸。四环素，土霉素，金霉素，强力霉素。,理化性质：,黄色结晶功能团：4位二甲胺基，酰胺基，酚羟基，两个含有酮和烯醇基的共扼双键系统（这两个系统决定抗生素的颜色和紫外吸收，前350nm后265nm成两性化合物性质 ，遇酸碱结合成盐固体性质稳定金霉素在20 3-5年效价不变。对各种氧化剂不稳定，在碱性溶液中最易氧化，溶液颜色加深可用于鉴别。,（一）呈色反应 1、浓硫酸反应 四环素 深紫色； 金霉素 蓝色至绿色； 土霉素 朱红色； 强力霉素 黄色； 2、三氯化铁反应：酚羟基（二）荧光反应:土霉素绿色荧光，四环素黄色荧光 （三）紫外光谱（四）色谱,四、大环内酯抗生素（microlides） 结构：一个大环内酯环为母核，通过糖苷键与1-3个糖相连。 （红霉素，阿奇霉素，螺旋霉素）,鉴别（一）呈色反应 1、硫酸反应：遇硫酸均呈红棕色 2、莫利西反应：糖类的反应 3、Seliwanaff 反应： 脱水 间苯二酚糖 糖醛衍生物 具颜色产物 红霉素 淡黄色； 螺旋霉素 亮紫红色；碳霉素 深青紫色； 柱晶白霉素 淡青色；,（二）薄层色谱 (三) 光谱学鉴别 紫外光谱 红外光谱,五、利福霉素类抗生素的鉴别,结构：一个脂肪链经过酰胺键与一个平面的芳香基团连接成一个环桥式化合物，所以又称环桥类抗生素。代表药物：利福平（rifampicin）鉴别：呈色反应：1 浓盐酸反应：2 三氯化铁：，向1ml利福霉素的溶液中，滴加三氯化铁乙醇溶液，有绿色，蓝绿色。表明有酚羟基3 硝酸盐反应：利福平，溶液中加入硝酸钠溶液，颜色由橙色变为暗红色。,六、多肽类抗生素：,含有多种氨基酸经肽键缩合而成的一类抗生素。可由放线菌、真菌或细菌产生。具有以下特征：1分子量较低，500-1500。2在动植物中常见的氨基酸很少出现，如蛋氨酸、组氨酸等。3常含有稀有氨基酸。4 常含类脂化合物。5 常含D-氨基酸。6不能为动植物来源的多肽酶（peptidase）所水解。7生物合成过程中，类似物多，分离困难。,短杆菌肽：线状的多肽放线菌素：有酰胺键和内酯键（用于癌症治疗的放线菌素D（更生霉素）作用机理：一、影响细菌细胞膜功能（多粘菌素，短杆菌素,抗感染）二、破坏DNA和肽多糖的合成（博来霉素，万古霉素）三、抑制RNA合成（放线菌素）鉴别： 茚三酮反应： 磷钨酸反应：（沉淀反应） 双缩脲反应：,第三节 抗生素类药物的杂质检查,一、高分子杂质、降解产物及异构体 1、青霉素 过敏原：青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白(青霉噻唑基团) 凝胶过滤法分离，用Penamaldate法测定 HgCl2 青霉噻唑衍生物 Penamaldate衍生物（285nm）,P187,2、链霉素毒性杂质: 链霉胍,链胍双氢链糖;双氢链霉素;链霉素醛基化合物; 神经毒性：二链霉胺二链霉胺含量测定原理:二链霉胺等不被KBH4还原，能与盐酸氨基脲反应，生成的缩氨脲在233nm有吸收峰,在2010版中国药典控制5个阿奇霉素相关物： 红霉素A偕亚胺醚 3-N-去甲基阿奇霉素 3-O-去克拉定糖阿奇霉素 阿奇霉素杂质Gx 阿奇霉素B欧洲药典和美国药典标准中列出了16种和13种相关物相比较,3 阿奇霉素有关物质的检查,在 中国药典(2015年版)的阿奇霉素条目中,采用高效液相色谱配合紫外检测器法检测药物,并要求控制8个阿奇霉素相关物 : 杂 质 A (氮 红 霉 素 )、 杂 质 B (阿 奇 霉 素 B)、 杂 质 H (3-N - 4-乙 酰氨基苯基磺酸基 -3-N-去甲基阿奇霉素、杂质 I(3-N-去甲基阿奇霉 素)、杂质 J(阿奇霉素 J)、杂质 Q (红霉素 A-6,9-亚胺醚)、杂质 R (红霉素 A 9,11-亚胺醚)、杂质 S(红霉素 A-E-肟)。,照含量测定项下的色谱条件液相色谱仪阿奇霉素B峰面积不得大于对照溶液主峰面积1.0%阿奇霉素Gx与红霉素A偕亚胺醚按校正后的峰面积计算不得大于对照溶液主峰面积的0.5%，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5%各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2.0%,阿奇霉素有关物质的检查,4、土霉素 脱水土霉素、差向土霉素、-阿扑土霉素、-阿扑土霉素等降解产物 薄层分离，荧光测定5、四环素 脱水四环素、差向四环素、差向脱水四环素 HPLC测定,二、无机杂质的检查三、溶媒残留量 1、比色法： 甲醇氧化成甲醛，用品红试剂测定 丙酮与水杨醛缩合比色 醋酸丁酯与盐酸羟胺反应后比色测定 2、气相色谱 3、HPLC 4、红外光谱,第四节 抗生素类药物含量的测定法,一、容量法 二、光谱学测定法三、色谱法测定法,第四节 抗生素类药物含量的测定法,一、容量法（capacity test）（一）酸碱滴定法青霉素在水溶液中经水解后，产生青霉噻唑酸，可用酸碱滴定法测定。（二）碘量法 青霉素,第四节 抗生素类药物含量的测定法,二、光谱学测定法 （一）旋光法： -内酰胺类抗生素 （二）紫外分光光度法：麦迪霉素胶囊中麦迪霉素的含量 （三）比色法：链霉素的麦芽酚法测定链霉素效价,第四节 抗生素类药物含量的测定法,三、色谱法测定法（HPLC） 高效液相色谱法测定阿奇霉素的含量 高效液相色谱法测定青霉素的含量,盐酸金霉素Yansuan Jin