基因工程实验设计

基因工程实验设计DNA重组分子的构建及筛选检测 实验原理：Bt蛋白中的Bt是苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis的缩写。毒蛋白是其产生的一种伴胞晶体，有时也称为delta-endotoxin，即学术刊物中中文所对应“delta 内毒素”。“毒”是指其对特定的物种有毒性，并非对所有的生物体都有毒性。而且不同的Bt菌系产生的毒蛋白的特异性也不同。Cry14-4是从苏云金芽孢杆菌中获得的一中新的杀虫晶体蛋白样基因，对棉铃幼虫有较强的杀虫活性。实验步骤一目的基因的获得1. 在NCBI网站上查找目的基因的核心序列 1 atgtatatgg ctgaaattaa acgtttagat tattatttag gtgccttgcc ttttggtaat 61 ttttatgtag atgattgtga tactttaaaa aattttatag atagcctttt agatggtaaa121 ccttctacaa tgaataatac tcctctaaca ggtaatgtaa atgttacaaa tcaaagtgtt181 actatcttag atgatttaga ttccatagca accctaaccc cagaatatgt atatgataat241 tatttttcta atgatacaag tactgaaaaa acttatcaaa ccttatcttt tgagaaagat301 gtacaaacaa cagttagtac aactgttacc catggattcc aaattggagg gaaacttgga361 gctgaagtaa aaggaagtgt aagtattcct ttcgttgcag atggtggggt tactgtaagt421 gcagaaattt ctggacaata taatttttct tcagcagata cagaaacaac aacaacttct481 caaaaattaa ttattccttc tcagtccggt aacattcgac ctggttatac aacaagggtt541 caaattatgt tagcaaaaat taatattcca caaacagcag ttcatttttc tggttctatg601 tcaggaacag tacatcggga tccaatccct agtagtgtaa taggtttggt agactacgat661 ttatatgatg aagtaaggtc tctagaaaat aattgttcaa attcaacagt aggtagagat721 acaggtttag tattaaataa cgctaatcaa agtgtagatt tttcaggaag tggatttttt781 actggttcaa ttactgcatt taatttttat gtaaaaatta ctgaatatcc aattaataat841 tcttcccaag aaaatataag atggtactca atagaaccaa aagtattaaa tcaatcaatt901 atacgacatc gttttccttc aaattcttct gtgaatactt gtaattgcta a2.根据所查序列运用primer 5.0进行引物设计3.确定适合引物的序列及位置,设计酶切位点及加保护碱基 上游引物：5CCCCGGGATGTATATGGCTGAAA3 Sma1 下游引物：5CGAGCTCTTAGCAATTACAAGTACC3 Sac1 所选限制性内切酶酶切序列及酶切点: Sma1:CCCGGG Sac1:GAGCTC4.菌体培养：将获得的苏云金芽孢杆菌于YT液体培养基，于30振荡培养过夜，获得足够的菌体。收集菌体(注意吸干多余的水分)。 辅助裂解：如果是G+菌，应先加溶菌酶100g/mL 50L。37处理1h。 运用CTAB法提取DNA。将提取的DNA用PCR扩增获得目的片段。2 构建克隆载体质粒（pEASY-T1质粒）1. 连接T载体，转化大肠杆菌，涂平板（LB固体培养基加Kan和Amp），37培养12-16小时后，菌检（M13引物）。 附图：质粒pEASY-T1图谱 原理：很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3端加上一个突出的碱基A。pEASY-T1载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3端带有一个突出的T。这样，pEASY-T1载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pEASY-T1载体中，形成含有目的片断的重组载体。 反应体系：T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液10 x buffer，无菌dd Water2. 从菌检正确的菌落上挑菌摇菌（LB液体培养基加Kan和Amp）12-16h后，提取质粒，送去检测。3 表达载体的构建（pBI121质粒） 附图：pBI121质粒图谱 酶切体系：30C TangoTM buffer 1X Sma1 Sac11. 将目的片段确定正确的T质粒酶切，跑胶，切胶回收，获得带酶切位点的的目的片段，目的载体PBI121也进行酶切，跑胶，切胶回收。2. 将酶切片段和酶切后的载体连接。四目的基因的检测与筛选1.将表达载体运用CaCl2法转化大肠杆菌，涂平板（LB固体培养基加Kan），12-16h后，菌落PCR（所设计的引物）。2.从菌检正确的菌落上挑菌摇菌（LB液体培养基加Kan和Amp）12-16h后，提取质粒。进行酶切验证。将酶切验证结果正确的菌落的质粒转化农杆菌，涂平板（YEB固体培养基+Kan+Rif），长出菌落后，菌检（所设计的引物），将菌检正确的菌落挑菌，摇菌，提取质粒