蛋白质水合作用

蛋白质水和作用研究进展,郭顺堂,结合水、结构水及水和层的概念,众所周知，生物高分子可使溶解高分子的水分子层结构化，蛋白质含25-70%，核酸为80%。引起盐析的试剂可从高分子中夺取部分水和层使高分子沉淀。如同酒精脱水效果。将这部分固定化在分子表面的水称为结合水（Boundwater),高分子与水的结构化,一般高分子的表面被亲水残基占据。亲水残基的水分子结合：离子基团的水和作用；极性基团的氢键结合。实际上有大量疏水性残基露到水介质中，大量亲水基团埋在高分子的内部。水和高分子表面残基间的作用：水在疏水域的强烈结构化；芳香环上的氢键结合。,水和高分子古典模式,沿高分子作用力同心方向配置，第一层结合水，越远离高分子，结构化的水越少。高分子周围的水形成了与自由水（bulkwater）不同的环境。结构水形成高分子的水和层（hydrationshell），厚度：0.6-50nm。高分子周围水：结构水(Structuralwater);极化水（Polarizedwater）；束缚水（strainedwater)；邻接水（vicinalwater）。,亲水性水和,水分子在高分子的亲水部分通过解离基水和、极性基氢键作用被结构化。一般水分子对羟基的氧原子提供质子、或对胺基（氨基和亚胺基）接受质子，（水）O-HO,（水）OH-N氢键结合能是共价键的1/20，原子及介质中各种结合力，3-6kcal.mol-1.弯曲角度130o，长0.27-0.31nm，故，处于控制介质热运动影响的亲水部分成了高分子各种立体结构振动场。,亲水性水和举例,结合组织中的葡萄糖胺类的粘多糖、果胶酸等都数多聚负离子性高分子。由于存在大量的同符号电荷的相斥作用，不能形成球蛋白那样的结构，分子成纤维状支链结构，接触介质的表面积达到最大。高分子表面的负离子基团在介质中吸引Na+，形成高分子-离子-水复杂的结构。,1、粘多糖类水和作用,粘多糖是由含有硫酸基的二糖类结合而成，通过糖的负解离基和羟基吸引水。粘多糖凝胶按杜南平衡原理彭润。粘多糖分子有秩序地占有空间，通过负电荷吸引周边的阳离子。而阳离子再吸引其他离子，在多糖的周围的一定空间内形成了阴阳离子交互层。在两个被离子包围的高分子交界处因富含质子层，pH较低，且有水通过双极子强烈排列。,多聚阴离子性高分子和水的集合,电荷分布对粘液质的机械性质发挥了决定作用。非常大的弹性，或“拉丝性”状态高分子各层因相同或相反电荷呈现复原力或相互滑动。,2、葡萄糖胺聚糖的水和,由结合蛋白质的酸性多糖组成。具有分支的分子，分支部分因相同电荷的相斥性扩展成相当大的容积。水和的分子约300nm，远大于平均直径3-4nm的球状蛋白。同粘液质一样，钠是主要的对离子。,糖胺与金属离子结合模型,结合在高分子上的Na+,K+并不一定表现为单纯一价离子的行为。图中Na直接或介于水分子与4个链结合，其中Na通过配位键与6个氧结合，其中4个结合在糖链上，其他2个结合在水分子上，这2个水分子通过氢键结合在糖链上。这种错体化合物几乎不水和，离子对通常的反应物处于封闭状态。,疏水性水和,疏水性是无极性分子对水的不溶性，无极性分子不是对水的斥力，而是避开水的作用。分子周围不能存在水和层的无极性分子因相互十分接近而存在，通过较强的范德华力相吸引，因热运动2个分子接触后难以分离。这种力随分子质量而增大。无极性分子疏水性按分子量增大。无极性基CH3C2H5CnH2n1为了保持状态，亲水基占据高分子表面的大部分，包围了分子内一定体积中的疏水残基，提高了疏水残基间的范德华力，形成类似于薄板型结构。,尽管有上述特性，在某种条件下，特别是稀释倍率大时，“疏水分子和水会合”，形成完全特别的结构，因水分形成“小筐”结构，进一步地集合成水化物(hydrate)或包接化合物（clathrates)。,Clathrates(包接化合物）,无极性物质使处于分子周边的水结构化，形成能结晶化的非常稳定的结构物。该结构物的融点远高于冰；无极性物质含有的水分能达到90%，化合物的水合能也比较高。无论化学性质怎样，水和能几乎一样为，15kcal.mole-1.表明：水合物的稳定性不依存于特定性质，而依存水的性质。,包接化合物的构成要素,与疏水分子接触通过氢键作用集合的水，形成1边约0.5nm的五角形结构而构成的多面体。,与冰的六角形结构不同，包接物中水形成边长为0.5nm的五角形多面体。多面体各顶点被水分子的氧原子占据，各边由氢键结合而成。形成网状结构将无极性分子包围其中。化学上非常不同的物质但有时显现同一性质，主要是受表面水的影响。,各种无极性物质的水和热,包接物水的结合作用,水与各种疏水残基接触、配置，参与蛋白质立体结构的稳定性作用。包接物中强烈结构化的水形成某种“幕”，隐蔽了其下面氨基酸的化学性质。包接物中水分子间的结合作用强于纯水，焓变也比较小：原因：形成包接物水分子的可能配向数少，因为形成氢键比其它结合作用有利于节省能量，各水分子不是面向浪费结合可能性的溶质方向，而是采取4个结合方向，象乘马的方式配置在疏水分子上。,与无极性溶质接触的水分子配置水分子象乘马样在溶质分子上，同时确保能与其他水分子结合4个位置，这样水分子在溶质表面的切线方向能形成2个或3个氢键。,疏水分子浓度与包接物形成,增加疏水分子浓度就加强了疏水作用，如果2个分子接触各自的包接物水就会重新构成。最终，封闭在包接物中的疏水物质变大，分离成水相和无极性相。在结晶蛋白质中，包接物结构的氢键朝向一定方向，可用x射线衍射来分析（胰岛素、细胞色素等），这些结晶含有30%水，水合率过高会失去结晶结构而不能分析。,包接物的水相和无极性分子相的分离过程1、水分子过剩时，水分子在无极性分子周围配置成“筐状”，形成包接化合物，水可达到90%。2、3、无极性分子增加时，水分子之间为了尽可能保证氢键，同时避开2个无极性分子夹持，其结果水分子向外滑出，成为一个包有数个无极性分子的“筐”，而两个无极性分子间接近通过范德华力结合而稳定化（疏水作用）。4、无极性分子进一步增大，水分子呈液状集结，成球状液滴。,水和苯环间的氢键结合(Benzeneformshydrogenbondswithwater,Science.1992,257,942-945),水分子的氢原子露出阳性核，被围绕苯环分子的电子云吸引，氢键不是朝向碳原子而是朝向本环中心。苯环的该性质说明，具有疏水侧链的酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸并不一定埋在蛋白质内部，苯环也有理由常朝向外侧。,具有苯环和双键结合的芳香族化合物能够结合1分子的水，水分子1个氢原子能与围绕苯环的电子云之间形成氢键。,4、分子内的水,结合在高分子上的水并不专一地位于其分子周边，而是有不可忽视的量被封入高分子内部。被埋于蛋白质内部的水一般被3-4个配位数所饱和，而且，和邻接原子保持同等程度的结合并处于低频率震动状态。表明水被固定成准固体状态。水常位于含有代谢的活性中心的口袋位置，参与循环功能。特别是与存在于触酶部位深处的亲水氨基酸相结合。由于高分子内部水的结合引起了氢键断裂和再结合，其结果带来了大量的能量消费。被结合的水分子实际上被看作蛋白质的一部份，与其功能和结构相关。,水和高分子的形状,高分子占有三维的空间结构，但结构水实际上在高分子的周围形成了二维的膜。因此，和高分子接触并强烈受到影响的水分反过来能够影响控制高分子形状和活性。氢键因其特性有时会表现为制约，有时会产生各种现象。所以，生物高分子的各种形态和功能是由高分子本来结构与水的各种作用的结果。,高分子立体结构与水和层,60年代，蛋白质的三维结构概念：认为亲水氨基酸位于蛋白质分子表面，疏水性残基在分子内部。疏水残基的相互作用而收缩，对蛋白质分子折叠被认为是重要的稳定化因素。Fischer定义：具有极性或电荷的残基，具有某种溶解性，但球状蛋白内部几乎不存在溶解性残基。相反，无极性残基是完全不溶性的，水合层中是没有的。同样的原则，多糖类和核酸、糖蛋白等的亲水性残基的排列也受支配。因亲水性残基，这些分子呈纤维状展开，不存在折叠结构。以上原则对高分子三维形态预测至今未失影响力。,但是，蛋白质分子表面和内部的氨基酸分配问题非常复杂：亲水性残基处于与水环境的接触面，疏水残基被埋入螺旋和折叠中，这一观点过于简单。在蛋白质分子内部含有不可忽视比例的亲水性氨基酸，在其表面有突出状无极性残基。即使在蛋白质分子内部，羟基、氨基、巯基等亲水残基，或电荷分布在产生氢键、双硫键和离子键时，水分子被排除，能够形成疏水性结构。因此，疏水残基绝不被水湿润的观点是错误的，即高分子内部有水这一现象也绝不少见。,亲水性残基能够构成疏水性领域,1、显示具有氢键结合的水和极性残基和通过静电作用水和解离基的2个多肽。2、极性残基排出水和水分子，具有电荷残基竞争性地相互逐出水和水而接近，使得2条链通过氢键和离子键结合，如果成为这种结构，对水就完全无亲和性。,各种球状蛋白质的水和程度,Fischer是研究蛋白质结合水量和蛋白质分子量及极性程度关系的第一人。当蛋白质为球形，半径为r，亲水残基所占表面体积：Ve=4/3（r3-（r-d）3）1疏水残基所占内部体积：Vi=4/3（r-d）32全体积：Vt=Ve+ViFischer极性系数或亲水性系数定义为：p=r3/（r-d）3-13,因此，相对于全体积Vt，在可能的范围给与最小的p价。如果分子是扁长椭圆体，亲水性程度会更大；如果分子量变小，r-d减少（假设层厚d一定），p的比率变大。因此，这就存在“分子量最小界限”，Fischer认为大约为7000，分子内仅存亲水性残基。分子量为16000Da（150残基）的值对于极性表面和疏水中心部平衡是最适价。根据Fischer对各种氨基酸组成不同蛋白p的计算，计算值常常大于完全球形；若分子量相同，越细长越是亲水性的。有时也有特例发现，与单体接触的表层中隐藏着亲水残基。Fischer计算虽然不正确，但是很好的近似法。特别是推测出了不存在分子量5000以下的蛋白质。！（Clegg认为应当有，但未发现！）,表示亲水性残基比率的极性系数p与蛋白质的形状和大小的变化,1、若多肽链过短，分子内部就没有存疏水性残基的场所，分子量小的蛋白质成为更亲水性的；2、更大的分子链随着p的增大则呈细长型；3、p值比计算预测值小时，实际上是隐蔽了部分亲水残基的多聚体。Ve和Vi分别表示亲水残基及疏水残基所占的分子内体积。,各种蛋白质的水和程度：几乎相等,根据上式1-3，Ve=p/p+1Vt此处，Ve几乎等于表面积A与厚度d的积；d用0.4nm置换，则A=p/p+1Vt/0.4（nm2）根据上式，Fischer用极性程度p计算了所有蛋白质的水和度Ht(分子体积Vt与分子量成比例)结果：与实验得到的值一致，Ht变异非常地小，其平均值：0.288%。即：若蛋白质的水和程度和分子量没有关系的话，就意味着能显著变动的是蛋白质的形，即表面积/体积的比率随p而变化。,水和蛋白质分子的能量关系,可以想象：无极性的残基被埋入蛋白质分子的内部，构成了非常稳定的能量状态，因此，蛋白质分子从其状态逃逸是困难的。但这种想法也不合实际，蛋白质分子的形不断在变化，当然，水向残基接近的容易程度和能量状态也是在不断变化的；在此多样变化过程中，水发挥着微妙的作用。,焓和熵的补偿及高分子形态（水的性质之1）,RufusLumry和ShyamalaRajender发表：蛋白质和低分子物质的水溶液中焓和熵的补偿现象：水的普遍性质。水接受来自于溶质的变化同时也接受能量的变化。不管溶质的变化怎样这一能量变化是相同的。存在与T无关的比例关系H=TcS（G=H-TS）根据观察结果，溶质分子小或水溶液中，焓变和熵变间存在特别的直线关系。比例关系系数在250K-315K之间，即在生物反应的温度范围内部依存于温度。,焓和熵的补偿依存高分子的形状变化，依存水结构化程度。系统内机械功（焓变）与水分子秩序化程度相联的（熵）。结构化水比普通水储存了多余的能量，表现出高比热现象。Lumry和Rajender：接触蛋白质水的自由能变化引起了其蛋白质分子的变形，水也接受变形。水和层作为机械能量的传布途径。这个能量传送非常有效率，比压力变化传热、热运动传热要迅速。冷血动物：金枪鱼，其血红蛋白的氧化几乎不依存温度，能够在大洋的表层和深层等温度不同的场所激烈移动。恒温动物：焓和熵的补偿对恒温动物没有关系。重要的是自由能的变化，另外在代谢方面，不仅仅是肽链那样折叠的大变动，就是很小的分子形状的改变都具重要代谢活性的意义。,麻醉剂,其作用机制是焓变和熵变补偿的典型：疏水性强的物质达到神经组织时将结合的蛋白质水和水再组织化成包接化合物形，从而使蛋白质结构变化。麻醉物质显示大的溶解焓和熵变化，在加入到10%酒精时，在使水的结构变化的条件下其补偿效果特别显著。,亲水残基在折叠结构的稳定化和亚基会和方面的作用,Ben-Naim1990研究了高分子折叠或会和时，即埋入的氨基酸水和时的自由能变化：与自由能相关的变化与其说是疏水性侧链集团间的相互作用关系，倒不如说是亲水性集团间的相互关系。因此，分子内或分子间接触的领域大部分是亲水性残基。,疏水结合引起的不稳定化,Privalov（1989）：与Fischer的“基本前提”原则相反，提出：疏水性相互作用并不限于蛋白质分子的折叠和会和（聚合）的稳定化。这种作用主要由范德华力和水分子竞争引起，如果无极性的残基间处于水分子大小以下时，起主导作用的是范德华力，残基之间会凝聚。Muller（1992）：有机溶媒中蛋白质分子内疏水残基紧密集结；但Privalov研究的能量变化结果：高分子立体结构的变化，残基间比水分子变大时，水合力的排斥作用促进了分离。这是因为，浸透到无极性残基的水分子妨碍了残基的再次相互接近。,结合在酶表面的水与触媒活性,研究水和程度与酶的物理化学性较多的是溶菌酶。它是直径数纳米的球蛋白。酶分子水和的3个阶段，一般球蛋白遵从此原则：1、以蛋白质荷电基团与水发生相互作用为主，1分子结合60分子水（0-0.07g/g）2、基于蛋白质表面极性基结合60-200分子水(0.07-0.25g/g)，水和同时可观察到质子移动度增加。当水和220分子（0.25g)时酶表现活性，并随水和度增强。水分子之间通过氢键组织化。3、当结合300分子水（0.38g),蛋白质仍是固体，但蛋白质分子表面基本被连续的水层覆盖。水分再增加，溶菌酶由固体转向液化。,蛋白质表面立体配置为最小限水分子覆盖,蛋白质表面强制水和水再分配，即蛋白质和水相互作用的几何学只允许某种配置。发现：蛋白质在没有配体存在状态时，不论是脱水和或再水和过程，都保持三维结构。（与传统观点矛盾）说明蛋白质折叠结构和外部环境的关系。蛋白质将接触可能的表面最小化给与水媒质尽可能少动摇保持结构稳定。原因：结合水每分子占2nm2，是自由水2倍。水分子最初结合的离子基或极性基突出，形成了2nm2的“洼”，使无极性基团隐蔽而使水的接触最小。,酶活性与蛋白质表面的质子移动度是否有关？在各种pH测定移动度，当水和度达到某临界点时电容迅速增大，并和质