生物工程下游技术--色谱分离

Chapter7色谱分离(层析分离)(CR)ChromatographicResolution,7.1概述7.2色谱分离原理7.3各种色谱分离技术,7.1概述,概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，利用多组分混合物中各组分物理化学性质(如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等)的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物化性质的差异而以不同的速率移动，使之分离-经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。,ChromatographyTechniques,俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)色谱法是一种分离技术试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,色谱分离的特点,分离效率高；应用范围广：极-非；离子型-非；小-大分子；无机-有机；热稳-不稳选择性强：选不同参数、不同的固定相、不同的洗脱方式、不同的操作条件达分离要求；高灵敏度在线检测色谱分析CA过程自动化。,色谱分离方法的分类,按原理不同分：吸附色谱(AdsorptionC.)：吸附力不同(物理、化学)分配色谱(DistributionC.)：分配系数不同离子交换色谱(IEC)：离子交换树脂的化学亲和力差凝胶色谱：分子大小或形状不同(GelC.)分子筛色谱亲和色谱(AffinityC.)：生物大分子的专一结合能力,按固定相形状分：,柱色谱分离(ColumC.)填料纸上色谱分离(PC)滤纸作为载体薄层色谱(TLC)：上两个结合，分析用凝胶色谱：凝胶为载体,按流动相的物态分：,气相色谱GC能气化的物质液相色谱LPC超临界色谱SFC流动相SFCO2,低(，当连续加入洗脱剂，且柱有足够长度，则混合物中三种组分逐渐分开，分子跑在最前面，最先从柱中洗出；2)展开(development)：加入洗脱剂使各组分分开的操作3)色谱图(chromatogram)：展开后各组分的分布情况,GelFiltration,IonExchange,HydrophobicInteraction,Affinity,ReversedPhase,PrinciplesofOperationforChromatographyTechniques,7.2.2色谱分离的分配机理,可由Langmuir方程得出Kd-分配系数，反应了消耗在固定相上的时间及在柱中的停留时间。q、c-溶质在固相和液相中的浓度,平衡关系：在任一瞬间，对每一组分来说，在固定相和移动相之间都存在着一个动力学平衡分布，这个分布用分配系数Kd表示。,保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一,阻滞因子Rt阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异,色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N-理论塔板数tR-保留时间W1/2-半峰宽Wb-峰底宽度理论塔板高度：L-柱长,Resolution=PeakseparationPeakwidthatheight,ResolutionfactorRs,Efficiency:IsameasureofpeakwidthHighefficiencymeanssharppeaksHighefficiencymeansagoodpackedcolumnHighefficiencycancompensateforlowselectivity,Selectivity:IsameasureofpeakseparationHighselectivitygivesbaselineseparationsIfselectivityishigh,lowefficiencycanbetolerated(iflargepeakvolumeisacceptable).,Resolution:dependsonefficiencyandselectivity,N=Numberoftheoreticalplates,Efficiency:thequalityofyourcolumn,Testsolution:1%acetone(about0.5%ofcolumnvolume),0.2AUFSat280nm.Alternativelyuse2MNaClandconductivitymonitor.,HETP=L/N,HETP=HeightequivalentoftheoreticalplatesL=Lengthofpackedcolumnbed,Efficiency,Efficiencydependson:ParticlesizeofmatrixParticlesizedistributionofmatrixPackingqualityofthecolumnSample(volumeandviscosity)Flowrate,7.3.1吸附色谱(absorptionchromatography),原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离关键要素：吸附剂和展开剂的选择吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2,7.3各种色谱分离技术,常用的吸附剂：氧化铝硅胶活性炭纤维素聚酰胺硅藻土,展开剂的选择,展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果展开剂选择的原则：（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力,吸附色谱涉及吸附剂、被分离化合物和展开剂三者之间的相互竞争，到目前为止还只是凭经验来选择。三角形图解法可初步估计：,应用举例：丝裂霉素的精制。丝裂霉素的发酵滤液用活性炭吸附，丙酮洗脱，蒸去丙酮的浓缩水溶液，用氯仿萃取。氯仿萃取液上氧化铝柱，先用氯仿冲洗，能部分分带，接着以氯仿-丙酮(3：2)展开，约2h后，能分图示的色带。其中蓝紫色色带d为有效成分丝裂霉素C。将柱推出,切取蓝紫色部分，用10%甲醇-氯仿洗脱，减压蒸干，在甲醇-苯中结晶，即可得蓝紫色丝裂霉素C结晶。,一般吸附色谱的操作程序,根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物,7.3.2分配色谱(partitionchromatography),原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法要素：固定相、载体、流动相,载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：硅胶硅藻土纤维素葡聚糖凝胶,固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱）*反相色谱固定相是非极性的流动相是极性的,应用举例：,6.3.3HPLC,HPLCChromatogram,反相液相色谱,反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性,载体：微粒多孔硅胶（粒径5m20m）HypersilSpherosilXOB075固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质C18适于分离核酸苯基流动相的选择通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃,SourceRPC,InfluenceofParticleSizeontheSeparationeffect,Whyusereversedphase?,RPCgivesthehighestresolutionSimpleeluents:waterandorganicsolventsEasymanipulationofresolutionbychangingparametersRemovingspecificcontaminantsUnfortunatelydenaturingforlargerproteins,6.3.4离子交换色谱(ionexchangechromatography),利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。,Whyuseionexchange?,UsefulatallstagesofpurificationandatallscalesControllableHighselectivityHighcapacityConcentratingHighrecovery,常用的离子交换树脂,葡聚糖凝胶型DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纤维素系列离子交换剂DEAE-SephacelCellex系列琼脂糖系列离子交换剂Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交联琼脂糖离子交换剂,Source系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂S系列阴离子交换树脂Q系列MonoBeads系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列,6.3.5分子筛凝胶色谱(GFC),利用相对分子质量差进行分离的色谱分离技术。大分子质量者先洗脱出(先出峰)。(又称为排阻色谱)优点：操作简便分离效果好，重复性高，回收率高分离条件温和应用广泛适用于生物大分子的初级分离，脱盐分辨率低,分子筛凝胶色谱原理,凝胶装置图,色谱峰和分离结果,ProsFastestforbufferexchangeVerygentle,highyieldsWorksinanybuffersolutionRemovesdimersandaggregatesSeparatesbysize,ConsLimitedsamplevolumePoorselectivitycomparedwithSDS-PAGE,Whyusegelfiltration?,Desaltingproteins,proteins,salts,凝胶色谱填料,葡聚糖凝胶SephadexG-系列聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl系列琼脂糖凝胶Sepharose系列Superose系列,应用：分子量的测定,蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:,LogM=k1-k2Ve,（Ve为洗脱体积）,先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。,除抗原性杂质(如青霉素致敏原),青霉素致敏原因是由于产品中存在一些高分子杂质，如青霉素聚合物，或青霉素降解产物青霉烯酸与蛋白质相结合而形成的青霉噻唑蛋白，具有强烈致敏性的全抗原。这种高分子杂质可用凝胶色谱法分离，方案如下：取葡聚糖凝胶G-25，粒度为2080m。色谱柱直径1.7cm，高37cm，带有冷却夹套，冷却水温度为810。展开剂采用pH=7.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。样品加入量为凝胶床体积的4%10%。青霉素浓度为1：1.2或1：1.5(即1g青霉素溶于1.2mL或1.5mL缓冲液中)，流速lmL/3min，每5mL收集一管洗脱液。分出的高分子杂质有噻唑基反应。,7.3.6疏水作用层析(HydrophobicInteractionChromatography）,Hydrophobicinteractionchromatographyisaliquidchromatographytechniquethatseparatesbiomoleculesaccordingtotheirhydrophobicity,利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。,Na2SO41.0M,疏水层析操作,Whyusehydrophobicinteraction?,Complementarytoionexchange(IEX)andgelfiltration(GF)Mild,non-denaturingHighselectivityHighrecoveryConcentratingtechnique,7.3.7亲和色谱（Affinitychromatography）,在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,载体活化、配基连接、吸附、洗脱,Whyuseaffinitychromatography?,EasytoachieveotherwisedifficultseparationsSeparatenativefromdenaturedandfunctionallydifferentformsOften95%purityinonestepIsolatepuretargetsubstancefromexcessamountsofcontaminantsRemovesspecificcontaminantsFastseparations,7.3.8金属螯合层析(metalchelatingchromatography)利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。,金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的分离,7.3.9蛋白质分离常用的色谱方法,免疫亲和层析属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离免疫亲和层析介质的获得：（1）获得抗体（2）抗体连接到载体上,疏水层析在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。操作要点蛋白质的局部变性洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行,离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段操作要点：由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）,缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在1020mmol层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整洗脱方式：pH梯度离子强度梯度,AIEX,Technique,Purificationfactor,QSepharoseFF,10timespurification82%yield,PhenylSepharoseHP,HIC,Y.-F.Liaoetal.(1996)J.Biol.Chem.271,28348,Purificationofrecombinanta-mannosidasefromPichiapastoris,AKTAexplorer100色谱系统,AKTAexplorer100色谱系统工作流程,7.3.11纸层析,是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析介质：滤纸操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹,展开剂的选择,展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸-水（15：3：2）展开方式：上行色谱下行色谱径向色谱,7.3.12薄层色谱法,将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法常用的固定相有：硅胶和氧化铝优点：设备简单、操作方