逆转录与RT-PCR.ppt

第四节逆转录与RT-PCRReversetranscription&RT-PCR,2020/6/12,2,一、逆转录和逆转录酶的发现,实验现象：1、1964年，Temin等首次发现：DNA合成抑制剂可以遏制鸟类肉瘤病毒ASV等RNA肿瘤病毒所造成的感染表明在RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中需要合成DNA。2、ASV子代病毒颗粒的产生被放线菌素D所抑制说明转录对于RNA肿瘤病毒增殖可能是必须的。,2020/6/12,3,假想：DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌过程中的中间物这一过程大致为：RNA肿瘤病毒DNA原病毒（或前病毒）RNA肿瘤病毒。,2020/6/12,4,证明：1970年，Temin和Baltimore分别在RNA肿瘤病毒中发现了逆转录酶(reversetranscriptase)。HowardTeminandDavidBaltimore于1975年荣获诺贝尔生理与医学奖。,2020/6/12,5,二、逆转录病毒（retrovirus）,1.定义：含逆转录酶的RNA病毒称为逆转录病毒。所有的RNA肿瘤病毒都是逆转录病毒，但是，并不是所有的逆转录病毒都致癌。2.逆转录病毒的基因组：逆转录病毒基因组由两条相同的正链RNA分子组成，每个约8,500nt，其5端有cap，3端有ployA尾。,2020/6/12,6,2020/6/12,7,三、逆转录酶（reversetranscriptase）,定义：是RNA指导的DNA聚合酶。具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶、DNA指导的DNA聚合酶和RNaseH的活性。合成DNA的方向：逆转录酶合成DNA的方向为53。,2020/6/12,8,合成DNA的引物：不能从头合成DNA。引物为逆转录病毒包装时从宿主细胞获得的tRNA分子。一些鸟类逆转录病毒以宿主tRNATrp为引物，而鼠类逆转录病毒则以宿主细胞tRNAPro为引物。RNaseH活性：是指逆转录酶可以从53和35两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的RNA。,2020/6/12,9,四、逆转录,1.逆转录（reversetranscription）：是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。,2020/6/12,10,2.逆转录病毒基因组复制过程在逆转录过程中，新合成的DNA链要发生两次“跳跃”（jump），以改变链间碱基配对的位置，使双链DNA的两端产生相同的长末端重复序列LTR(longterminalrepeats)。LTR中含有整合信号、转录信号（启动子）、增强子和polyA位点等序列，通常只有左侧LTR中的启动子和右侧LTR中的polyA位点发挥正常功能，这是由它们所在的位置所决定的。,2020/6/12,11,2020/6/12,12,逆转录原理的应用RT-PCR,反转录PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）：是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链扩增（PCR）相结合的技术。,2020/6/12,13,RT-PCR过程,首先经反转录将RNA逆转录成cDNA然后以cDNA为模板，PCR扩增合成目的片段。,2020/6/12,14,模板RNA：总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。,2020/6/12,15,用于反转录的引物可视实验的具体情况选择：随机引物（randomhexamer）、OligodT及基因特异性（gene-specific）引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。,2020/6/12,16,OligodT：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于OligodT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。基因特异性引物：与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。,2020/6/12,17,2020/6/12,18,2020/6/12,19,注意事项,在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2.为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3.内参的设定：主要是为了用于靶RNA定量。常用的内参有Tublin、-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一等所造成的误差。,2020/6/12,20,4.PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。5.防止DNA污染：（1）采用DNA酶处理RNA样品。（2）在可能情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。,2020/6/12,21,RT-PCR的用途,1.检测细胞中基因表达水平；2.检测细胞中RNA病毒的含量；3.直接克隆特定基因的cDNA序列。,2020/6/12,22,2020/6/12,23,2020/6/12,24,一、mRNA差别显示技术概述,1992年，哈佛大学医学院的PengLiang和ArthurB.Pardee博士于创建发明的mRNA差别显示法，即DD法（differentialdisplayofmRNAbyPCR）；也称为差示反转录PCR（DifferentialDisplayofReverseTranscriptionalPCR）简称为ddRT-PCR，是一种新的研究基因差异表达的有力工具；它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。,2020/6/12,25,DD法的主要程序：将细胞内的mRNA抽提出来，反转录成cDNA，经PCR随机扩增，通过在测序凝胶上电泳条带的比较筛选出不同的表达的基因，并回收这些DNA片段，经扩增后作为探针，在cDNA或基因组DNA库中扫描找到相关基因。原则上如果选用不同的引物组合，这个方法可以检测到细胞中约15,000种不同基因的表达情况，这就给出了一个类似于蛋白质双向电泳的指纹图谱，基因表达的不同马上就可以知道，并因此分离到该基因。,2020/6/12,26,二、mRNA差别显示技术基本原理,合成两组引物，随机组合1利用真核生物mRNA具有多聚腺苷酸（polyA）尾巴的特点(PolyA序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性)，设计了一组1012个寡聚胸腺嘧啶，同时再附加AGC三种核苷酸中的任意两种作为mRNA3端的锚定引物，其通式为5-T11MN；即采用Oligo（dT）12MN为引物合成cDNA，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类。用这些引物在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。,2020/6/12,27,为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5端设计了20种10bp长的随机引物。以合成的cDNA第一链为模板，在PCR反应中，掺入32P或35S标记的dATP或dCTP，这样正常与异常细胞间差异表达的cDNA片段可以通过DNA测序凝胶显示出来，经过Northern杂交分析确证后，这些差别显示的cDNA可以作为探针，用于进一步分离cDNA及基因组克隆，达到最终分离基因的目的。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20,000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。,2020/6/12,28,2020/6/12,29,返回,2020/6/12,30,三、mRNA差别显示技术的实验流程,2020/6/12,31,2020/6/12,32,返回