质谱分析法--定性与定量.ppt

北京市海淀区产品质量监督检验所国家食品质量安全监督检验中心2011年06月23日,质谱分析方法定性与定量,ThebirthofVenus,LCandMS:AMatchMadeinHeavenJamesJorgenson，UniversityofNorthCarolina59th，ASMS，June5，Denver，USA,TheArnolfiniWedding,阿尔诺菲尼的婚礼扬.凡.艾克1434,主要内容,一、质谱基础及相关术语二、定性（确证）方法三、定量方法,质谱仪的基本结构,GCLCICCE,EI、CIESIAPCI、APPIMALDIDART-,四级杆离子阱飞行时间磁质谱FT-ICR,一、质谱基础及相关术语,各种离子化方法的使用范围,选择的依据挥发性热稳定性极性,质量范围,质谱仪所能测定的离子质荷比的范围不同仪器不同应用,质谱仪主要性能指标,扫描速度,分辨率,色谱峰的数据点数目和峰宽、扫描时间有关,质谱仪主要性能指标,质谱仪主要性能指标,磁质谱的分辨率定义最为严格：对两个相等强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时，则认为两峰已经分开，其分辨率：,磁质谱中，R不随m/z变化，在测定小分子时有优势eg.R=5000，500与500.15000与5001,分辨率,有机质谱仅要求50峰谷刚刚分开就算分开（这时称为有机质谱的单位质量分辨）简化为用单峰法表示，即测定一个峰半峰高处的全峰宽FullwidthhalfMaximum（简写为FWHM）,分辨率,eg.FWHM=0.25m/z=100，R=400m/z=1000，R=4000,分辨率,例如：要区分以下离子，分辨率要达到CO+27.9949N2+28.0061,ArCl+74.9312As+74.9216,atto摩尔级的灵敏度；优于2ppm的MS质量准确度优于5ppm的MS/MS质量准确度线性动态范围可以达到五个数量级；质量分辨率至20,000高速数据采集能力（每秒获得10张MS/MS谱图），更好地兼容超快速液相色谱宽质量范围：m/z范围从2520,000u,举例：,质谱峰类型分子离子必须是化合物谱图中质量最高的离子必须是奇电子离子、符合氮规则必须能通过丢失合理的中性离子，产生谱图中高质量区的重要离子准分子离子碎片离子同位素离子由于天然同位素的存在，因此在质谱图上出现M+1，M+2等峰，由这些同位素所形成的峰称之为同位素峰,一、质谱基础及相关术语,术语,1-Cl,2-Cl,1-Br,2-Br,3-Br,4-Br,Beynon表例如：M=150化合物M+1M+2化合物M+1M+2C6H14NOCl8.150.49C7H11N49.250.38C6H14O46.861.0C8H6O38.360.95C7H2O47.751.06C8H8NO29.230.78C7H4NO38.131.06C8H11N2O9.610.61C7H6N2O28.500.72C8H12N39.980.45C7H8N3O8.880.55C9H10O29.960.84,二、定性（确证）方法,质谱法只有在与色谱分离在线或脱机联用时才能作为确证方法在分析仪器上的进样顺序是：空白溶剂、阴性控制样品、要确证的样品、阳性控制样品再进样，最后是阴性控制样品,1.基本原则,保留时间实验室条件下分析物的最小可接受保留时间，2t0气相色谱（GC）或液相色谱（LC）时，半峰宽应在原来峰宽的90-110%以内，保留时间的变化应在5%以内,二、定性（确证）方法,2.色谱分离,保留时间测试部分中分析物的保留时间（或相对保留时间），应在一个特定的保留时间窗口范围内与校正标准的保留时间相符。保留时间窗口与该色谱系统的分辨能力相当。分析物和内标的保留时间之比，应与校正溶液的相对保留时间一致，GC偏差为0.5%，LC偏差为2.5%,二、定性（确证）方法,2.色谱分离,GBT16631-2008高效液相色谱法通则：同样条件下重复试验的保留数据的分散性，RSD3%JJG705-2002液相色谱仪检定规程：定性测量重复性（6次测量）RSD1.5%JJF（闽）10322010液相色谱-质谱联用仪校准规范：定性重复性RSD2%JY/T0211996分析型气相色谱方法通则：整机重复性保留时间RSD5,二、定性（确证）方法,关于保留时间的讨论,GB/T22260-2008饲料中甲基睾丸酮的测定高效液相色谱串联质谱法试样保留时间与标准品的相对偏差不大于15%GB/T22147-2008饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的测定液相色谱质谱联用法样品与标准品保留时间的相对偏差不大于0.5%,二、定性（确证）方法,关于保留时间的讨论,全扫描scan选择离子监测SIMMS-MSn技术，如多反应监测MRM,二、定性（确证）方法,3.质谱检测,全扫描scan用记录全扫描质谱图进行质谱测定时，在标准品参考图谱中所有相对丰度10%（分子离子、分子离子的特征加成物、特征碎片离子、同位素离子等）的特征离子都必须检测选择离子监测SIM用碎片离子色谱图进行质谱测定时，分子离子最好是一个选择的检测离子。选择的检测离子并不一定要源于分子的同一部分。每个检测离子的信噪比应31,二、定性（确证）方法,3.质谱检测,相对离子丰度最大容许偏差,二、定性（确证）方法,二、定性（确证）方法,2002/657/EC规定：要确证指令96/23/EC附录I-A组所列的物质，最少需要4个识别点，包括具有促合成作用和其他未允许的化合物，如二苯乙烯类化合物及其衍生物、盐、酯等、抗甲状腺剂、甾醇、二羟基苯甲酸内酯如玉米赤霉醇、-受体激动剂等要确证指令96/23/EC附录I-B组所列的物质，最少需要3个识别点，包括兽药和污染物，兽药如抗菌药、驱虫药、抗球虫药、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、镇静药、非甾体抗炎药等；其他环境污染物如有机氯、有机磷、真菌毒素、染料等,质量碎片类型和识别点的关系,每个离子计算一次EI-GC-MS、CI-GC-MS作为不同的技术计算用不同反应得到的衍生物，可增加识别点数包括二级离子和多级离子可最多结合三种不同的技术确定最小识别点数,二、定性（确证）方法,m/z+202122,m/z-17979.9,ESI-,ESI+,甜蜜素SN/T1948-2007进出口食品中环己基氨基磺酸钠的检测方法,应研究样品基质和检测器性能引起的图谱改变,外标法内标法标准加入法基质效应,三、定量方法,三、定量方法,1.外标法,单点校正法外标标准曲线法,三、定量方法,单点校正法实际上是利用原点作为标准曲线上的另一个点，当方法存在系统误差时（即标准工作曲线不通过原点），单点校正法的误差较大,单点校正法,三、定量方法,以纯溶剂配制标准工作溶液GB/T21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法“根据样液中被测四环素类兽药残留的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液”，“对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定”GB/T22147-2008饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的测定“采用M+1的准分子离子的色谱峰面积做单点校正定量”,单点校正法,三、定量方法,以空白样品提取液配制标准工作溶液GB/T21320-2007动物源食品中阿维菌素类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法“分别取适量试样溶液和相近浓度的基质添加标准工作溶液，做单点校正”，“对标准工作液和样品溶液等体积参插进样进行测定”,单点校正法,三、定量方法,以纯溶剂配制标准工作溶液GB/T22260-2008饲料中甲基睾丸酮的测定高效液相色谱串联质谱法GB/T22955-2008河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中苯并咪唑类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T21324-2007食用动物肌肉和肝脏中苯并咪唑类药物残留量检测方法,外标标准曲线法,三、定量方法,以空白样品提取液配制标准工作溶液GB/T23409-2009蜂王浆中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法GB/T23408-2009蜂蜜中大环内酯类药物残留量测定液相色谱-质谱/质谱法GB/T22986-2008牛奶和奶粉中氢化泼尼松残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T22978-2008牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定液相色谱-串联质谱法,外标标准曲线法,三、定量方法,空白样品加入系列浓度的标准工作液，提取后得到系列基质标准工作液GB/T21312-2007动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法GB/T22969-2008奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T水果、蔬菜中啶虫脒残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T21313-2007动物源性食品中-受体激动剂残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法,外标标准曲线法,a:以纯溶剂配制标准溶液，测定的峰面积Aab:以空白样品的提取液配制标准溶液，测定的峰面积Abc:在空白样品加入标准溶液，提取后得到基质标准溶液，测定的峰面积Ac绝对回收率Ac/Aa，包含提取效率和基质效应提取回收率Ac/Ab，不包含基质效应绝对回收率=提取回收率*绝对基质效应GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测“如果检测结果用回收率进行校准，应在原始记录的结果中明确说明并描述校准公式”,三、定量方法,三、定量方法,2.内标法,单点校正法内标标准曲线法,三、定量方法,2.内标法,内标物要满足以下要求：（a）试样中不含有该物质；（b）与被测组分性质比较接近；（c）不与试样发生化学反应；（d）出峰位置应位于被测组分附近。,内标法计算式,准确称取一定量的试样m，加入一定量内标物ms，试样中待测物的含量wi为：,内标法特点,(a)内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大(b)内标物和被测组分处在同一基体中，因此可以消除基体带来的干扰(c)若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：,内标标准曲线法,内标标准曲线定量方法,配制系列标准溶液，分别加入等量的内标物,混合后进行色谱分析。以待测组分的浓度为横坐标，待测组分与内标物峰面积（或峰高）的比率为纵坐标建立标准曲线（或线性方程）,在分析未知样品时，分别加入与绘制标准曲线时等量的内标物，用样品与内标物峰面积（或峰高）的比值，在标准曲线上查出被测组分的浓度或用线形方程计算,三、定量方法,内标标准曲线法,以纯溶剂配制系列标准工作溶液GB/T23406-2009肠衣中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法GB/T23407-2009蜂王浆中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法GB/T23411-2009蜂王浆中17种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法GB/T23412-2009蜂蜜中19种喹诺酮类药物残留量的测定方法液相色谱-质谱/质谱法,三、定量方法,内标标准曲线法,以空白样品的提取液配制系列标准工作溶液GB/T22992-2008牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T22959-2008河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T20756-2006可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法,三、定量方法,内标标准曲线法,空白样品加入系列浓度的标准工作液，提取后得到基质标准工作液GB/T21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱串联质谱法GB/T21310-2007动物源性食品中甲状腺拮抗剂残留量检测方法高效液相色谱-串联质谱法,内标的选择,GB/T22286-2008,保留时间min,SN/T1924-2007,三、定量方法,3.标准加入法,先测定出未知样品的大概值，然后根据这个测定值去设定标准加入法标准加入法中第一点加入标准溶液为“0”，第二点加入的量约与待测组分的含量大致相等，共35个点，以加入的标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制工作曲线工作曲线在横坐标延长线上的交点到坐标原点的距离即为样品中待测组分的浓度,三、定量方法,3.标准加入法,标准加入法可以看作是内标法和外标法的结合由于待测组分以及加入的标准溶液处在相同的样品基体中，因此，这种方法可以消除基质干扰但是，由于对每一个样品都要配制三个以上的、含样品溶液和标准溶液的混合溶液，因此，这种方法不适于大批样品的分析,前提具有线性关系，并且标准曲线通过坐标原点尽可能减小系统误差试样的基质效应不得随被测组分含量对干扰组分含量比值改变而改变必须扣除背景和空白值,3.标准加入法,三、定量方法,三、定量方法,概念产生机制来源如何评价如何消除,4.基质效应,三、定量方法,基质效应是指在样品测试过程中，由于待测物以外的其他物质的存在，直接或间接影响待测物响应的现象由于质谱检测的高选择性，基质效应的影响在色谱图上往往观察不到，即空白基质色谱图表现为一条直线，但这些共流出组分会改变待测物的离子化效率，引起对待测物检测信号的抑制或提高,4.基质效应,三、定量方法,待测物与基质成分的电荷竞争形成气态离子的竞争改变表面张力，形成大液滴，不充分的去溶剂化,基质效应的产生机制,三、定量方法,内源性的：来源于待测样品，如蛋白、脂质、多糖、目标组分的类似物，其他色谱共流出物外源性的