酶免疫分析技术

第三章 免疫分析,第一节 免疫分析法概述,一、抗原基本概念与性质,1.抗原和抗原的两种性能,抗原：指能够刺激机制免疫系统发生免疫应答，产生抗体和/或致淋巴细胞，并能与之特异性结合、发生免疫反应的物质。 免疫原性：指抗原能够刺激机体免疫系统发生免疫应答、产生抗体和/或致敏淋巴细胞的功能。 免疫抗原性（免疫反应性或反应原性）：指抗原能与相应抗体和/或致敏淋巴细胞特异性结合、发生免疫反应的性能。,抗原决定簇：存在于抗原分子表面的能够决定抗原特异性的特殊化学基因，又称表位。 抗原特异性取决于抗原决定簇，即由抗原决定簇的种类、性质、数目和空间构型决定。,2.抗原决定簇(antigenic determinant),TD抗原（大分子蛋白质）,TI抗原（多糖）,3.抗原结合价,抗原结合价：是指一个抗原分子上能与相应抗体发生特异性结合的抗原决定簇的总数。,两种不同的抗原分子上所具有的相同或相似的抗原决定簇称为共同抗原或共有决定簇，亦称交叉反应性抗原。,4.共同抗原,抗体的概念：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,二、抗体基本概念及其性质,IgG的一级结构,抗原抗体反应：指抗原与相应杭体之间所发生的特异性结合反应。 抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性。 特异性： 比例性：,三、抗原抗体反应,抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型，而抗体的特异性则取决于抗体Ig Fab段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。,可逆性： 抗原与抗体通过很弱的短矩引力而结合，如范德华引力、静电引力、氢键及疏水性作用等。,第二节、酶联免疫吸附试验（ELISA）,酶联免疫吸附试验（ ELISA ）：结合在固相载体上的抗原（抗体）与待检抗体（抗原）酶偶联物（标记物）反应后，催化水解或氧化还原酶的相应底物呈色，其颜色深浅与待测抗原（抗体）含量成正比。,一、原理及特点,特点：灵敏度高、特异性强、准确性好；酶标记试剂能够较长时间保持稳定；操作简便、对环境没有污染；易与其它技术偶联；衍生出适用范围更广的新方法。,二、ELISA常规技术,常规使用的ELISA技术主要有： 直接法（direct ELISA）：测抗原 间接ELISA：测抗体 双抗体夹心ELISA：测抗原 双位点一步法：测抗原 竞争ELISA：测抗体或抗原及半抗原,1.直接法（direct ELISA）,将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的抗体，加底物显色测定。即可测定抗原总量，此抗体的特异性非常重要。优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。缺点：试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。,2. 间接ELISA,基本原理：利用酶标记的抗球蛋白抗体（第二抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。,主要用于对病原体抗体（一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体）的检测而进行传染病的诊断（如抗HBc、抗HBe ）,间接ELISA法示意图,3. 双抗体夹心ELISA,基本原理：将包被在微量反应板上的已知抗体与待检抗原进行反应，再加上酶标抗体和底物，通过显色反应对抗原进行定性或定量。此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原。此法适用于多价大分子抗原检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。,双抗体夹心ELISA（测抗原）,4. 双位点一步法ELISA,基本原理：应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固相载体包被和酶标抗体，待检测抗原和另一个经酶标记单抗同时加入，形成固相单抗待检抗原酶标单抗复合物，加入底物显色后，根据颜色深浅对待检抗原进行定性或定量。,5. 竞争ELISA,竞争法测抗体 ：待测抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。竞争法测抗原 ：待测抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。,三、ELISA基本操作程序,(1)包被（coating）：使抗原或抗体吸附于固相载体表面。其机制可能是聚苯乙烯表面间的疏水基团可以无选择性地吸附蛋白分子。(2)封闭（blocking）：固相吸附蛋白是非特异性的，在包被目的免疫蛋白后，未吸附蛋白的固相表面仍然有吸附其它蛋白的能力，为了保障抗原抗体反应的特异性，因此，包被剩余的固相表面应该用抗原抗体反应无关蛋白封闭。,(3)抗原抗体反应：抗原或抗体在适当的介质下可进行特异的抗原抗体反应。(4)酶反应：酶可以通过共价键与抗原或抗体连接形成结合物，当抗原抗体反应的时候，被检测靶目标中也结合了酶分子。(5)底物反应：结合在抗原抗体中的酶分子，可以促使底物发生颜色反应，检测人员可以通过颜色来判定是否有免疫反应的存在，并可通过颜色的深浅判断标本中相应抗原或抗体的含量。,加样：即加待检样品、酶结合物和底物。（注意交叉污染和产生气泡）温育：常用温度：43、37、室温和4（冰箱温度）洗涤：是ELISA最主要的关键技术，目的是分离游离的和结合的酶标记物。洗涤方式自动板机、手工操作（浸泡式和流水冲洗式）显色：影响因素：反应温度和时间；OPD底物液应避光显色，硫酸终止。（TMB显色终止液：叠氮钠、SDS、各类酸性终止液）比色：以蒸馏水校零点，测读样品孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程）,ELISA操作要点：,四 、生物素-亲和素系统 （BAS）,基本原理：通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，借助生物素化酶或酶标亲和素引入酶与底物反应系统 BAS-ELISA可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等,1. 基本概念,生物素（biotin，B）：又称辅酶R或维生素H，是在动植物中广泛分布的一种生长因子，以辅酶形式参与各种羧化酶反应。其分子量244.31，咪唑酮环是亲合素结合的主要部位，噻唑环侧链戊酸末端羧基是抗体和其他生物大分子结合的唯一结构。, 噻吩环,I 咪唑酮环,羧基,亲和素（avidin，A）：又抗生物素蛋白、卵白素或亲和素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量68kDa。亲合素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。链霉亲和素 (streptavidin，SA) ：是链霉菌在培养过程中分泌的一种稍偏酸性的蛋白质产物，分子量 65KDa。,结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基PI 10.5 6结合位 色氨酸 色氨酸生物素 4 4Ka 1015 1015活性 1315 1518,亲合素（A）,链霉亲合素(SA),2. 基本原理,BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。,生物素亲和素系统原理图,标记蛋白质的活化生物素,3. BAS-ELISA分析模式,3.1 桥联亲和素-生物素法(BRAB),基本原理：抗原与生物素化的抗体结合后，通过游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，达到多层放大效果，又称BAB法。,3.2 标记亲合素生物素（LAB）法,基本原理：生物素化抗体与抗原结合后，继而跟酶标亲合素结合，如此提高了检测抗原的敏感性。,应用实例：,人血清整分子胰岛素放大ELISA实验步骤：1. 用包被液将单抗HUI-018（表位位于胰岛素A环第8-10aa） 10g/ml包被酶标板（100l/孔），封闭液封闭（100l/孔），洗涤。2. 每孔加入25 l人胰岛素标准或被测血清和75 l生物素化单抗OXI-005（表位位于胰岛素B链C末端），作用2h后洗涤。3. 每孔加100l HRP标记的亲和素，作用30min后洗涤。4. 加入TMB底物溶液（100 l/孔），显色10min；加入100 l/孔 4mol/L H2SO4终止反应，450nm处测定A值，绘制标准曲线。 该法测定人血清中整分子胰岛素的灵敏度为5.0pmol.,3.3 亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法）,基本原理：将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，待检抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高检测抗原的灵敏度。,4、优越性,1.灵敏度 生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比活度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。,2.特异性 亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。,3.稳定性亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。,4.适用性生物素和亲和素均可制成多种衍生物，不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系，而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。此外，多种BAS的商品化试剂，为临床检测和科研工作提供了有利条件。,5.其他 BAS可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂（如生物素化第二抗体等）适用于不同的反应体系，而且都可高度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是BAS与成本高昂的抗原特异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用此外，由于生物素与亲和素的结合具高速、