仪器分析第三章-分子荧光

主要内容荧光的产生荧光效率与化学结构的关系荧光光度法的定量依据荧光光度计应用,第3章分子荧光分析法,1荧光的产生,荧光:以辐射驰豫的形式回到基态时的发射光在分子荧光分析中，常以紫外光及可见光区的辐射作为激发能，所发生的荧光则多在可见光区,问题：分子荧光光谱是连续光谱吗?,（二）激发光谱曲线和荧光光谱曲线荧光为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱曲线来确定。固定测量波长为荧光最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱曲线激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光谱曲线,1.荧光发射光谱的形状与激发波长无关由于较高激发态通过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高,远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层2.Stokes位移-分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长受激分子通过振动弛豫而失去转动能;or溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。,荧光发射光谱的特性,3.镜像规则通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系.为什么?你是如何理解的?,3.镜像规则通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系.why?,吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层形成的。其形状决定于第一电子激发态中各振动能层的分布荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能层回到基态中各不同能层形成的。所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能层的分布情况。基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布情况是类似的。因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为相似,Stokes荧光,共振荧光l激发=l荧光,4.2荧光效率与荧光分子结构的关系一.荧光效率(荧光量子产率),F越大，化合物的荧光越强。有分析应用价值的荧光化合物,其荧光量子产率通常在0.11之间,F=,发射的光子数,吸收的光子数,kf,kf+k,1,kf：辐射跃迁的速率常数k：各种非辐射跃迁过程的速率常数之和,=,二.荧光与有机化合物结构的关系从分子结构来说,绝大多数能发荧光的物质为含有低能的*跃迁能级的芳香环或杂环化合物1.共轭效应电子的共轭程度越大，就越容易被激发,分子的荧光效率越大,而且其最大荧光波长也会相应地“红移”向长波长方向移动,例：导电性高分子材料,2.刚性结构和共平面效应,给电子取代基,产生n-共轭效应,加强荧光。,3.取代基的影响,a.,得电子取代基,会使荧光减弱,如硝基苯无荧光。,4.金属螯合物的形成,近几年来,发现了8-羟基喹啉铝络合物有一个新的应用:作为小分子发光材料,用于有机电致发光器件中,5.化学环境对荧光的影响,温度：温度越低，F越大,溶剂：极性越强，F越大,pH值的影响,荧光的猝灭,荧光物质的分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起其荧光强度降低，消失或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象,原因：,碰撞,猝灭剂分子与荧光物质发生化学反应溶解氧的存在:氧化荧光物质自猝灭:高浓度时发生(自碰撞失活),3.3荧光的定量分析,荧光分析光度法的定量依据,IFC,荧光物质的荧光强度应正比于其吸收的激发光的光强。即:,IF=k(I0I),根据比尔定律：I=I010-ebc,代,得：IF=kI0(1-10-ebc),将式的指数项按Taylor级数展开,若ebc0.05(即A0.05),可得：,IF=2.3kI0ebc,当I0、b一定时,IF=kc,定量分析方法,工作曲线法,标准加入法,测定条件的选择,线性范围,防止自猝灭现象的发生。A0.05,IFc,选择合适的激发波长和荧光波长,4荧光分光光度计,问题：与紫外-可见光分光光度计相比,它在构造上有哪两点不同?为什么要这样?,光源要求强度大,适用波长范围宽。目前常用氙弧200-800nm范围内连续发光。样品池低荧光材料。如石英检测器荧光的强度通常较弱,故要用高灵敏度的检测器如光电倍增管单色器两个单色器均采用光栅来分光,3.5应用,荧光法灵敏度高(why?)、取样量少无机、有机、生化、医药和临床检验等领域都得到了越来越广泛的应用,无机化合物,简单无机化合物常无荧光或荧光强度很弱,故不能用自身的荧光来分析M+RMR能与有机试剂反应生荧光络合物的元素达60多种。其中Be、Al、B、Ga、Se及某些稀土元素的分析首推荧光法,有机化合物,脂肪族与其它有机试剂作用后生成荧光性化合物，再进行测定。,芳香族具有共轭电子,多能自身发荧光。可直接测定被测物自身的荧光进行分析。如蛋白质、各种酶与辅酶、维生素等,在医学检验、药物分析、生物化学、毒性分析中的应用,荧光探针法测定蛋白质,原理：Mn+与含有OH或CO的有机染料(发荧光的分子)相遇时，氧原子中的弧对电子可顺利地进入杂化轨道，形成稳定的配合物。在酸性条件下，该体系遇到结构不对称的蛋白质分子时，互相极化产生静电作用而生成新的大分子，改变了原体系的光谱性能，从而能定量测定蛋白质的含量。为增大染料和蛋白质的溶解度，常加入表面活性剂。如Ti(iv)-4,5-二溴苯基荧光酮-Tween-80与蛋白质的显色反应可测定尿中蛋白，尿液中其它成分不干扰。,色胺的测定,色胺广泛存在于各种植物和动物的组织中。尿液中色胺的含量是新陈代谢的一个重要标志。,直接荧光法（简便方法）pH1114时用苯萃取色胺,再用稀盐酸反萃取，pH=10,lex=285nm,lem=360nm，线性范围为0.18mg/15ml,荧光衍生法灵敏度提高,四氢大麻醇是一种常见的兴奋剂，当它在人体血液中含量为350ng/ml时就会相当兴奋，但它在被吸入后10min内，含量将急剧下降，2h后只有1ng/ml左右。从吸毒到被抓获一般都有2小时以上，如何能准确无误地做出吸毒与否的结论呢?,血液和血清中大麻醇的测定,3.6化学发光分析,某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法化学发光也发生于生命体系，这种发光称为生物发光,化学发光反应必须的满足条件:（1）化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源于反应焓（2）要有有利的化学反应历程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。（3）激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分子，而使该分子激发，然后以辐射光子的形式回到基态。,化学发光反应效率cl，又称化学发光的总量子产率:cl=发射光子的分子数/参加反应的分子数化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由参加反应物质的化学反应所决定。每个化学发光反应都有其特征的化学发光光谱及不同的化学发光效率,化学发光反应类型直接化学发光和间接化学发光直接发光是被测物A或B作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。A+BC*+DC*C+h,间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产物C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁回基态，产生发光。A+BC*+DC*+FF*+EF*F+h,气相化学发光和液相化学发光（1）气相化学发光主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。,（2）液相化学发光用于此类化学发光分析的发