基因工程的重组连接.ppt

基因工程的重组连接DNA连接酶,DNA连接酶,概念：DNA连接酶存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将DNA双链上相邻的3羟基和5磷酸基团共价形成3-5磷酸二酯键，使断开的DNA切口连接起来，因此它在DNA复制、修复以及体内体外的重组过程中起重要作用。分类：E.coliDNAligase:需要烟酰胺腺嘌呤（NAD+）作辅助因子，NAD+酶酶-AMP，同时释放出烟酰胺单核苷酸（MMN）活化的酶复合物在DNA切口处修复磷酸二酯键，并释放AMP。T4DNAligase：由T4噬菌体基因编码，分子量约为60KDa。其活性以ATP为辅助因子，它与酶形成复合物，并释放磷酸焦磷酸基团。,DNA连接酶,目前基因工程所使用的DNA连接酶多是来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶，因为它与大肠杆菌DNA连接酶相比，具有以下特点：修复双链DNA上的单链缺口（二者均相同），这是两种DNA连接酶的基本特征；连接DNA-RNA杂交双链上的DNA或RNA缺口，其中后者反应速度较慢；连接完全断开的2个平头双链DNA分子，反应速度通常是粘头连接的1/10-1/100，因此这种反应属于分子间连接，反应速度依赖于2个DNA分子与酶之间的随机碰撞，所以速度较慢。但是若适当提高酶量以及底物浓度，或在反应体系中加入适量的一价阳离子（如150-200mMNaCl)和低浓度PEG可以明显改善平头DNA分子的连接。,DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接反应的影响因素1.酶活单位：1国际单位（U）的T4-DNAligase的定义为：在最佳缓冲系统及15，1h内完全连接1g-DNA的Hind片断所需的酶量。2.T4-DNAligase的缓冲条件：50100mmol/LTris-HCl(pH7.5)10mmol/LMgCl25mmol/LDTT1mmol/LATP一般连接反应的总体系控制在10-15ul内。同样T4DNA连接酶储藏于50%的甘油中，而过高的甘油浓度对酶活也有抑制。因此酶的总用量也不要超过总体系的1/10。,DNA连接酶,影响T4DNA连接酶连接反应的因素：温度：大多数限制性内切酶产生的粘性片段的Tm为15，另一方面T4DNA连接酶本身最合适的反应温度为37，5以下活性大大下降。因此在实际操作中，我们多采用过夜15-16连接；离子浓度：过高或过低的离子浓度会影响反应速度；DNA片段：DNA末端的性质如果为粘性末端可以看作分子内的连接反应；但如果为平头DNA分子之间连接，则是分子间连接，速度大大下降；DNA浓度、DNA片段的大小分子内连接：片段与载体的摩尔数比=2：13：1分子间连接：51.1/(DNA浓度：g/L)(分子量：dalton)的值如果小于1则容易发生分子间的连接反应一般性规律是：DNA浓度越稀越容易发生分子内连接反应。,DNA连接酶,普通连接反应的设计：总体系10ul10buffer1ulVector(3k;500ng/ul)1ulDNAfragment(500bp;50ng/ul)3-5ulLigase0.5-1ulH2O加水至10ul,DNA连接酶,重组率及其影响因素：重组率：是指连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子与所投入的载体分子数之比；重组率与连接效率的关系：一般情况下，连接效率越高，重组率越大（针对定向克隆而言）；如果外源DNA片段与载体DNA分子均是经过一种限制性内切酶处理，那么重组率和连接效率就成为了两个彼此独立的事件了。因此在此过程中，连接产物就成为两种，即重组分子和载体自我环化或空载。此时的连接效率就高于重组效率。因此有些措施能够提高连接效率但是并不意味着能够提高重组效率，如增加酶的用量，延长反应时间等；如何提高重组率：提高外源DNA片段和载体DNA分子之比（2-10：1），这样就可以增加外源DNA片段和载体分子之间碰撞的机会；减少载体分子之间以及载体DNA两个末端之间的接触，从而降低载体自我环化；,DNA连接酶,在连接前用碱性磷酸单酯酶处理载体DNA，去除其5端的磷酸基团，这样即使DNA载体分子的两个粘性末端发生退火，也不能形成自身共价环化结构；在连接反应之前，用末端脱氧核苷酰转移酶（TdT)在载体分子的3羟基末端聚合一段同种碱基的寡核苷酸，防止载体分子之间以及两个末端自连，而在外源DNA片段的3端加上与之互补的寡核苷酸，二者退火后再连接。,无反应,DNA连接酶,DNA分子重组的方法：相同的粘性末端的连接：如果外源DNA分子与DNA载体均使用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶切还是双酶酶切，两种分子均具有相同的粘性末端，因此混合后它们可以顺利连接成为一个重组分子。相同的双酶酶切：定向克隆单酶酶切：重组分子有两种情况，即正方向插入和反方向插入。但无论如何，用原有的限制性酶切酶可以将外源片段DNA和载体DNA切开（如何鉴定片段为正向或者反向插入）；用两种同尾酶分别切割DNA片段和载体DNA（如DNA建库中，Sau3AI酶切外源DNA，而-phage载体用BamHI处理），其实产生了4个相同的粘性末端，因此分子之间可以直接连接，但连接后大多数情况下是用原有的两种同尾酶无法将片段和载体切开，这种酶切口称为“焊死”作用。当然少数情况下产生的连接重组分子可以被一种酶切开（如可以被Sau3A切开）。,DNA连接酶,DNA连接酶,平头末端的连接：T4DNA连接酶既可以连接粘性末端，也能DNA平头末端的连接。前者属于分子内反应，后者属于分子间反应，因此从分子动力学角度来讲，后者反应复杂得多，也慢得多，一般只有前者速度的1/10-1/100。因此，如何提高平头连接速度，包括：增加连接酶的用量，但这种操作在实际上很难实现，因为体系中酶量的增加无疑会影响甘油含量，对反应反而不利；增加平头末端的浓度，从而提高分子之间相互碰撞的机会；加入一定量的NaCl(或LiCl）以及PEG（终浓度1%）；适当提高反应温度。因为平头末端连接不存在分子末端退火的问题，因此提高温度，不仅可以增强连接酶的活性，还有利于提高分子之间的碰撞机会。反应温度在平头连接中多采用20-25；体系中高浓度ATP为平头末端连接的不利因素。ATP浓度1mmol/L会发生A在连接位点的随即插入；ATP浓度2.5mmol/L，会直接抑制平头末端连接反应。因此对大多数反应来说ATP浓度0.5mmol/L是比较合适的；对于平头末端的连接效率：HacIIIAlaIHacIISmaI,DNA连接酶,不同粘性末端的连接：不同的粘性末端在原则上无法直接连接，但是可以将它们转化位平头末端后再进行连接待连接的两种DNA分子具有5突出末端：两种分子均用Klenow酶补平，或用S1核苷酸酶切平，然后变成平端连接。一般用Klenow酶补平多见。而S1核苷酸酶不好掌握，容易造成双链DNA的降解反应；待连接的两种DNA分子均具有3突出末端：T4DNA聚合酶可以将这两种DNA的3突出末端切除，形成平头后再连接，所产生重组分子减少了碱基对；一种DNA分子具有突出的3末端，另一种具有5突出末端：一般采用T4DNA聚合酶切除3突出末端；5突出末端用Klenow酶补平，再进行连接；两种DNA分子分别含有不同的2个粘性末端：每一种DNA分子均用T4DNA聚合酶切平3突出端；用Klenow酶补平5突出端,DNA连接酶,人工粘性末端连接：上述不同粘性末端的连接大多数破坏了原有的限制性内切酶识别序列，导致重组的外源DNA片段不能回收，同时平末端连接效率低下。为克服这些缺点，可以用TdT处理经过酶切的DNA片段，使之在3加上同聚物尾，再进行连接。5突出末端：DNAKlenow酶补平以TdT加上多聚C的人工粘性末端；退火再用Klenow填补缺刻载体Klenow酶补平以TdT加上多聚G的人工粘性末端；3突出末端：直接用TdT在3末端加上两种多聚物的人工粘性末端退火Klenow填补缺刻平头末端：直接使用TdT加上多聚物的人工粘性末端退火连接Klenow修补缺刻，但与前二者不同之处是不能用原来的平口限制性内切酶切割。,DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶,酶切位点的定点变更：在有的分子克隆的实验中，需要将DNA上的一种限制性内切酶识别序列变成另一种酶的识别序列，以便DNA分子重组。有两种方法可以达到该目的：加装人工接头：接头是一段含有一种限制性内切酶识别序列的人工合成寡核苷酸，通常为8-10聚体。若DNA分子为平头末端，直接加上人工的接头；DNA分子若为酶切后的粘端，则依照5突出端用Klenow酶补平以及3末端用T4DNA聚合酶切平的原则，把粘端变为平端，同时消除原有酶切位点，再加上人工的接头；改造识别序列：用一种限制性内切酶的识别序列，改造另一种酶的识别序列，使前者移到后者的位置上。如将Alu识别序列改造成为EcoRI识别序列。Alu切开DNA片段DNA连接酶连接2个片段Alu转变为EcoRIEcoRI切开另一条DNA片段Klenow酶补平粘性末端具体分析我们可以发现，其实只要3端提供G碱基的限制性内切酶识别序列，包括粘端经Klenwo补平或T4DNA聚合酶切平，均可以变成EcoRI识别序列。,DNA连接酶,DNA连接酶,其它的工具酶,Klenow酶：大肠杆菌DNA聚合酶I的N端大片段；大肠杆菌DNA聚合酶I的活性：5-3DNA聚合酶活性3-5核酸外切酶活性5-3核酸外切酶活性核酸内切酶活性。而Klenow酶具有前两者的活性。Klenow酶的用途：修复3凹陷，使之成为平头；切口平移法标记杂交探针；合成cDNA的第2条链。,其它的工具酶,DNA模板,加热、变性,与6核苷酸随机引物退火,Klenow酶,T4-DNAligase,dNTP,32P-dCTP,杂交探针,其它的工具酶,TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）：是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，其合适的底物形式为3游离羟基的双链DNA。TdT的活性特点：3突出末端，TdT在Mg2+存在下可以将脱氧核苷酸dNTP随机加在双链DNA3末端；3为凹端或为平头时，需要Co2+激活，仍可以将dNTP加在3末端，且不按照模板；TdT的用途：在人工粘性末端构建中极为有用。,其它的工具酶,其它的工具酶,碱性磷酸单酯酶：可以催化DNA、RNA的5末端核苷酸去除P基团，使5成为-OH。碱性磷酸单酯酶的用途：单酶切后载体用碱性磷酸单酯酶处理，可以防止载体自我环化；片段或者接头5末端除去P，则可以防止DNA片段之间的连接。,其它的工具酶,其它的工具酶,T4多聚核苷酸激酶（T4PNP）：将ATP上的-P转移到单链DNA、双链DNA或RNA以及寡核苷酸5游离羟基。用途：用于DN