生物化学分析鉴定方法.ppt

第三章生物化学分析鉴定方法2蛋白质,本章内容概要及要求：,第一节：蛋白质的分析鉴定一、蛋白质理化性质测定（一）蛋白质含量测定（二）蛋白质相对分子量及等电点测定（三）蛋白质纯度测定二、蛋白质鉴定（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）（二）蛋白质序列分析（三）蛋白质结晶三、同工酶测定四、酶学分析在临床诊断上的应用第五节酶活性测定最适条件的选择,在蛋白质分离纯化过程中，需要对蛋白质的含量和纯度不断进行检测，通过优化纯化方法获得高含量、高纯度的蛋白质产品，为蛋白质的结构、功能分析及产品开发提供材料。为了鉴定某种微量蛋白质在样品中的存在，常采用蛋白质免疫印迹的方法，利用抗原抗体的特异性来鉴定。此外，还可测定蛋白质的氨基酸序列，对其生物学功能进行鉴定等。,一、蛋白质理化性质测定,（一）蛋白质含量测定（1）凯氏定氮：是最经典的蛋白质含量测定方法。氮素含量除16，或乘6.25即为蛋白质含量。适于较纯，粗蛋白值偏高。此法操作比较复杂，目前已不常用。（2）双缩脲法：快速不需十分精确。原理：两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成紫红色络合物，540nm波长最大吸收，值大小与蛋白质浓度成正比。含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应，肽键的反应，肽键越多颜色越深特点：受蛋白质特异性影响小应用：蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度，测定范围在mg/mL作用（3）福林-酚法（Lowry）：多年被选为蛋白质标准测定方法。原理：蛋白质与双缩脲试剂形成络合物后，蛋白质中的酪氨酸，色氨酸及半胱氨酸会使磷钼酸一磷钨酸还原生产蓝色物质，在650nm最大吸收，与蛋白质浓度成正比。特点：灵敏度比双缩脲法提高10倍左右，缺点是试剂的配制较为困难，费时间较长，很多物质对此法有干扰，比较适合于较纯蛋白的含量测定。,（一）蛋白质含量测定（4）紫外吸收法：此法简便快速。通过测定样品的紫外吸收值，根据经验公式或标准曲线也可以测定蛋白质含量。此法测定简单，而且不破坏样品，样品测定后可以再利用，缺点是样品中的核酸，高浓度缓冲液等具有紫外吸收的物质会干扰测定，引起实验误差。A、280nm和260nm的吸收差法：蛋白质在280nm波长有最大吸收，而核酸在260nm波长有最大吸收，对于较粗的蛋白质样品，可以利用280nm及260nm吸收差，用下列经验公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度(mgmL)1.45A280nm0.74A260nmB、215nm和225nm的吸收差法：蛋白质的肽键在230nm波长以下有强吸收。其吸收值与蛋白质浓度成正比。对稀溶液中蛋白质浓度的测定，可用下列经验公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度(mgmL)0.144(A215nm一A225nm)该法虽然灵敏度较高，但是干扰物质较多。,酪氨酸的max275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max257nm，257=2.0 x102;色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有、和有吸收光的能力。,（一）蛋白质含量测定（5）考马斯亮蓝染色法（Bradford）：目前应用最广。原理：考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，最大光吸收在488nm，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色，在595nm有最大吸收，大小与蛋白质浓度成正比。特点：此法测定简单，只要将蛋白质样品加到染料试剂中，即可进行比色测定。其灵敏度与福林-酚法相当，测定浓度范围在0.011.0mg/mL。高浓度缓冲液、尿素、甘油、蔗糖、硫酸铵等对测定有干扰。应用：该方法是目前应用最广的蛋白质测定方法之一。（6）胶体金测定法：是灵敏度最高的蛋白质测定方法。测定浓度范围为ng/mL水平。胶体金本身呈洋红色，与蛋白质结合后转变为蓝色，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，缺点是成本较高。,蛋白质理化性质测定,（二）蛋白质相对分子量及等电点测定分子量目前常用：1、分子筛层析法：可以测定活性多亚基蛋白质的相对分子量。2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：也可测定活性多亚基蛋白的相对分子量，但由于蛋白质的迁移率还受到分子形状、所带电荷等的影响，因此测定的分子量不够准确。3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：测定变性蛋白质中单亚基相对分子量的最有效最常用的方法。4、此外，还可以根据蛋白质特殊元素组成计算法、氨基酸序列推导法、渗透压法、沉降法、质谱法等。蛋白质等电点：等电聚焦电泳法主要方法，通过等电点沉淀可以测定蛋白质等电点的大致范围，通过蛋白质氨基酸序列以可直接预测蛋白质的等电点。生物信息法：http:/www.expasy.ch/,（一）蛋白质含量测定（二）蛋白质相对分子量及等电点测定（三）蛋白质纯度测定1、色谱法：如HPLC如果制备蛋白酶，需要利用的是蛋白酶的活性，只要其中的杂质不影响酶的活性即可，此时可以利用柱层析表示其纯度，在特定条件下，层析图谱只有一个或少数几个洗脱峰，也就是达到了色谱纯，可以满足常规的酶活分析等。如果通过结晶与再结晶的方法纯化蛋白质，则得到的蛋白质则为结晶纯，获得的晶体可用于蛋白质三维结构分析。2、SDS-PAGE法：通常情况下，蛋白质的纯度采用SDS-PAGE法。凝胶经过染色脱色后，用目标蛋白质条带占整个泳道蛋白条带的百分比来表示目标蛋白的纯度。,二、蛋白质鉴定,为了研究蛋白质的结构与功能，需要对蛋白质进行鉴定。蛋白质鉴定的方法有多种，比如成份测定（氨基酸组成及其含量），序列测定理化特性分析（蛋白质分子量，等电点，密度，变性与复性，结晶等）、生物活性及功能测定（比如酶活性分析，通过转基因技术进行突变回复等），对于一个蛋白质的鉴定，往往需要上述多种方法共同使用，相互印证，才能最终证明一个蛋白质是什么。序列测定：可以一步确定某一个蛋白，但蛋白质序列测定需要高纯度的蛋白，测序代价极高，因此其应用受到了较大的限制。免疫活性分析（蛋白质免疫印迹）：鉴定一个蛋白质，不仅弥补了传统鉴定方法需要多方印证的繁琐，而且代价相比于蛋白质测序要低的多，是目前使用最广泛的蛋白质鉴定方法之一。,蛋白质鉴定,（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）（二）蛋白质序列分析（三）蛋白质结晶,蛋白质鉴定,（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）28/151/re1/mei/html/jbzs/jb_index_elisa.htm免疫印迹（westernblotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。,（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）典型的印迹实验包括三个步骤：蛋白质的电泳分离将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。,（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）典型的印迹实验包括三个步骤具体解析：第一阶段为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（12A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。,蛋白质鉴定,（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）（二）蛋白质序列分析（三）蛋白质结晶,三、蛋白质组研究的相关技术（一）研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术：2-D电泳1.1975年，PatrickOFarrel发明了二维凝胶电泳。2.操作（1）等电聚焦。（2）平衡胶条。（3）第二相SDS-PAGE。,3.2-D胶上蛋白质鉴定（1）早期Westernblot鉴定（2）Edman降解法鉴定（3）肽质量指纹（peptide-massfingerprinting）技术鉴定（4）蛋白质组信息学,2D電泳Mass定序分析,（三）蛋白质序列测定肽序列分析的基本步骤：（1）分析已纯化蛋白质氨基酸残基的组成。（2）测定头尾氨基酸。（3）把肽链水解成片段，分别进行分析，得到肽图。（4）Edman降解,蛋白质测序发展简史1.英国科学家Sanger测序（20世纪50年代）。2.建立色谱技术和定量氨基酸分析技术（20世纪50年代）。3.Edman降解（20世纪70年代出现）。仪器自动化：液相自动测序仪和固相蛋白质自动测序仪。进入20世纪80年代，气相测序技术出现并实现了仪器自动化。灵敏度显著提高，样品量只需10pmol以下，一次连续测定的顺序甚至可超过80个残基。样品处理远比固相方法简单和操作方便。4.20世纪70年代，华裔学者张瑞耀提出的有色Edman试剂DABITC，使手工测序技术更加灵敏可靠。,5.对2-D胶上的点进行测序：将蛋白质转印到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后将膜片放入测序仪的反应室中进行Edman降解。6.毛细管电泳技术（20世纪90年代发展起来的微量分析技术）的采用，是蛋白质N端微量顺序测定方法学一个引人注目的发展。其灵敏度比HPLC高两个数量级。可在10fmol的水平检测氨基酸。微型测序仪与毛细管电泳联用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。,7.蛋白质C端测序：C端测序的重要性：为PCR扩增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依据；以及为基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据等。（1）最成功的方法是在Schlack早年提出的异硫氰酸法的基础上发展起来的。（2）直到20世纪90年代初由于发展出一些新的偶联和裂解试剂，配合用HPLC对乙酰内硫脲氨基酸（TH）的鉴定，该方法才得以较快地发展。目前已有自动化C端测序仪，能常规地进行6-8个残基的C端顺序测定。,8.质谱法用于蛋白质顺序测定：（1）必要性：DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰问题，Edman降解不能解决N端封闭肽的测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。（2）20世纪80年代初出现快原子轰击质谱（FAB质谱）能准确确定的分子量达到数千。相继发展的串行质谱可以把FAB得到的分子离子进行再一次惰性原子轰击，使肽链在不同部位断裂从而得到一组片段的质谱信息，使多肽顺序测定得以实现。,（3）20世纪80年代末出现了电喷雾质谱和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱。电喷雾质谱测定分子量数万的蛋白质准确度可达万分之一，主要优点是可与HPLC仪实现液质联用，因而能使一个蛋白质的酶解产物在得到HPLC肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。飞行时间质谱能对分子量达30万道尔顿的分子进行准确质谱分析。误差率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学结构分析已呈现极大应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的应用可成功地进行蛋白质C端与N端的顺序测定，该方法一个显著的优点是用样品量极微（1-2pmol），且非常快速，每次质谱分析只需数分钟。,9.质谱技术不能完全取代Edman降解与其他蛋白质分析方法。通常是联合运用这些技术。10.蛋白质测序展望：（1）N端测序仪在灵敏度上还需提高。（2）C端测序技术需要更新型的偶联试剂和更有效的裂解方法。（3）质谱技术将有令人刮目相看的作为。（4）一些新的分析技术很可能进入蛋白质顺序分析领域，如多维核磁共振方法。,蛋白质组：一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套的蛋白质基因组基本是固定不变的,蛋白质组却是动态的,具有时空性和可调节性,能反映出特定基因的表达时间、表达量以及蛋白质翻译后的加工修饰和亚细胞分布等。三大基本支撑技术：双向电泳技术(2-DE)计算机成像数分析与大规模数据处理技术以质谱技术蛋白质组的研究：是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。基因组：是指一个细胞单倍型(haploidy)所含的全部遗传信息,即DNA或RNA编码的遗传信息.蛋白质组则是指一个细胞一生中表达的蛋白质总和蛋白质组学：是指研究细胞或机体全部蛋白质的表达及其活动方式(包括翻译后修饰、转运定位、结构变化、蛋白质间及其他相互作用等),一、双向电泳,二、质谱技术,（一）概念：质谱（MassSpectrometry,MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。生物质谱技术电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol（10-12甚至fmol（10-15的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到迅速的发展。以下主要介绍与生物医学有关的几项质谱技术。,（二）分类1、电喷雾质谱技术（ElectrosprayIonizsationMassSpectrometry,ESI-MS）电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液一质联用（LCMS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。2、基质辅助激光解吸附质谱技术基质辅助激光解吸附质谱技术（MatriXAssistedLaserDesorption/Ionization,MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间（Time-of-Flight,TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。3、快原子轰击质谱技术（FastAtomBomebard-mentMassSpectrometry,FABMS）。4、同位素质谱,（三）生物质谱应用随着质谱技术的不断改进和完善，质谱的应用范围已扩展到生命科学研究的许多领域，特别是质谱在蛋白质、医学检测、药物成分分析及核酸等领域的应用，不仅为生命科学研究提供了新方法，同时也促进了质谱技术的发展。,、应用于蛋白质：1、蛋白质分子量的测定MALIMS技术以其极高的灵敏度、精确度很快在生物医学领域得到了广泛的应用，特别是在蛋白质分析中的应用，至今已被分析的蛋白质已有数百种之多，不仅可测定各种亲水性、疏水性及糖蛋白等的分子量，还可直接用来测定蛋白质混合物的分子量，也能被用来测定经酶等降解后的混合物，以确定多肽的氨基酸序列。可以认为这是蛋白质分析领域的一项重大突破。2、蛋白质组研究蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。质谱技术作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一，除了用于多肽、蛋白质的质量测定外，还广泛地应用于肽指纹图谱测定以及氨基酸序列恻定等。3、肽指纹图谱（PePtideMassFingerprinting,PMF）测定是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法，对质谱分析所得肽片与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽片进行比较，从而判别所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，因而不同蛋白质所得肽片具有指纹的特征。对肽序列的测定往往要通过串联质谱技术才能达到分析目的，它采用不同的质谱技术选择具有特定质荷比的离子，并对其进行碰撞诱导解高，通过推断肽片的断裂，即可导出肽序列,、应用于核酸常规的色谱或电泳技术只能对其浓度和纯度进行分析，而对其碱基组成、序列等结构信息却无能为力。ESI和MALDI质谱技术的出现为寡核苷酸及其类似物的结构和序列分析提供了强有力的方法，它是将被测寡核苷酸样品先用外切酶从3或5端进行部分降解，在不同时间内分别取样进行质谱分析，获得寡核苷酸部分降解的分子离子峰信号，通过对相邻两个碎片分子质量进行比较，可以计算出被切割的核苷酸单体分子质量，将其与四个脱氧苷酸的标准分子量进行对照，就可以读出寡核苷酸的序列。由于MALDI技术分辨率的问题，使得其更适合于减基数较少的短链核酸的分析。、质谱与临床医学除了应用于蛋白质和核酸研究以外，质谱还以其灵敏度和高分辨率在临床医学检直中得到了广泛的应用，如对药物代谢产物的动态分析，癌细胞蛋白质的鉴定，同位素标记物的检测等。其中用同位素14C标记的14C-尿素呼吸试验和15N标记的15N-排泄试验已成为临床检测胃幽门螺杆菌（HP）的有效手段。、质谱与检测随着生物工程技术的发展，大量的生物工程产品不断出现，传统的测定分子量及纯度的方法已不能担当此重任，现在人们把MALDI-TOF-MS应用于此领域，得到了很好的效果。蔡耘等用上述技术对重组的人表皮生长因子（hEGF）白细胞介素-3（IL3）、肿瘤坏死因子（TNF）粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）、粒细胞集落刺激因子（GCSF）碱性成纤维生长因子（bFGF）等六种基因工程产品进行了测定，获得了准确的分子量信息及纯度信息，这为基因工程产品的检测研究开辟了一条新途径。,denovodenovo”来源于拉丁文，意思是“创新根据离子的二级质谱和三级质谱的谱图，确定含有的氨基酸数量和种类，然后进行实际的谱图和理论谱图进行比对然后给出序列，通过这种方式不仅可以测序，还可以确定蛋白翻译后修饰（PTM）分析。denovo从头测序是生物学家的名称，化学家一般称为LC-MS/MS测序DENOVO是对于数据库里面没有蛋白或者相应核酸序列,所以通过对于多肽碎片的分析,从而知道它的氨基酸序列.但是对于具有相同质量数的LEU和ILE,对给序列分析带来一些困难.,泛素Ubiquitin：泛素是一个由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链,因其广泛分布于各类细胞而得名。泛素共价地结合于底物蛋白质的赖氨酸残基，被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解，泛素的这种标记作用是非底物特异性的，在蛋白质降解过程中泛素的枢纽作用越来越得到研究者的重视。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径，泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。2004诺贝尔化学奖,ELISA的原理原理动画动画ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶