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文档简介

.,实验二ERIC-PCR指纹图谱技术在分子生态学中的应用,.,实验目的,明确ERIC-PCR技术用于分析微生物群落结构的原理。掌握ERIC-PCR的操作方法。,.,ERIC(EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensus)-PCR,.,ERIC-PCR是一种长引物随机PCR技术,图谱稳定、重复性高，对底物的序列差异敏感性高，产生的图谱多态性丰富,.,PCR反应的一般原理,PCR:聚合酶链式反应，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。基本要素：DNA模板一对寡聚DNA引物（启动DNA扩增）TaqDNA聚合酶（催化DNA合成）缓冲液（提供DNA合成所需pH、离子强度等环境）dNTP（DNA合成的原料）,PCR原理,.,ERIC-PCR程序,95,7min94,1min(变性)52,1min(退火)30cycles68,8min(延伸)65,16min,.,实验材料,1.试剂,无菌水25mmol/LMgCl2溶液10扩增缓冲液:含500mMKCl,100mMTris-HCl(PH9.0),1%TritionX-1002.5mmol/LdNTP混合液20pmol/l引物E120pmol/l引物E25U/lTaqDNA聚合酶DNA模板（40-80ng环境样品总DNA）,.,2.仪器设备,.,实验步骤,制备PCRmixture(25lsystem)无菌水13l10buffer2.5l25mmol/lMgCl2溶液2.0l2.5mmol/LdNTP混合液2.0l20pmol/L引物E10.5l20pmol/L引物E20.5l加入模板DNA（40ng）4.0l,NC样品PC,.,放入PCR扩增仪，95变性7min取出PCR小管，迅速加入0.5lTaqDNA聚合酶，混匀，简短离心。（后加酶可保证模板变性完全且不损坏TaqDNA聚合酶的活性）,5.放入PCR扩增仪，按以下程序进行扩增：941min，521min,658min，共30个循环；65延伸16min，1个循环。,.,程序结束（约6.5h),取出PCR小管吸取2l扩增产物用浓度仪测定浓度,8.400ngPCR产物电泳9.凝胶成像，保存图谱,.,MrNCSPC,结果：,.,注意事项,避免污染PCR体系中所有试剂必须保证无其它杂菌DNA的污染。制备PCR混合物的操作应在超净台上进行。打开PCR扩增小管
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