第七章-食用菌菌种生产.ppt

第七章食用菌菌种生产第一节菌种概述第二节菌种生产设备第三节菌种培养基第四节接种第五节菌种培养与质量鉴定第六节菌种保藏与复壮,一、菌种概念二、菌种类型三、菌种生产程序,一、菌种概念,二、菌种类型,（一）目的不同的菌种,1、保藏用种：指用于中、长期保持菌种的生活力和原有性状的菌种。2、实验用种：供实验室进行科学试验、研究的菌种。3、生产用种（商业菌种）：供食用菌大面积栽培使用的菌种。,（二）级别不同的菌种,1、一级种（母种）,2、二级种（原种）,3、三级种（栽培种）,不可再扩,食用菌生产总过程,（三）状态不同的菌种,一、菌种生产程序,第一节食用菌制种的条件,制种程序,一、制培养基设备二、灭菌设备三、接种设备四、培养设备五、保藏设备六、菌种厂布局,一、制培养基设备（一）原料处理设备,切片粉碎两用机,拌料机,装袋机,（二）培养基分装设备,装瓶机,挖瓶机,菌种袋,颈圈,菌种瓶,二、灭菌设备,常压灭菌,常压,三、接种设备（一）接种环境,观察窗,紫外灯,操作孔,接种箱,2.接种室,使一定工作区达到相对无菌、无尘状态的电器,3.超净工作台,要求:前端为导热性好的金属材料,4.接种工具,固体菌种接种枪,液体菌种接种枪,四、菌种培养没备,1.培养箱培养少量菌种的恒温电器（2040）,2.培养室,五、菌种保藏设备保藏母种：冰箱（4）左右,六、液体发酵设备,七、菌种厂的布局根据菌种生产流程合理设置,一、概述（一）概念及要求（二）培养基的类型二、各级菌种的培养基（一）母种培养基（二)原种、栽培种培养基三、培养基的灭菌,一、培养基的概述（一）概念及要求,（二）培养基的类型l、按营养物质种类分类天然培养基常用的生物材料有马铃薯、胡萝卜、蚕蛹粉、豆芽汁、花生饼粉、玉米粉、酵母等。合成培养基是指用已知成分和数量的化合物配制而成的培养基。半合成培养基利用天然物质作为碳、氮源及维生素的来源另加一些无机盐类配制而成。,2、按培养基的物理状态分类液体培养基不加琼脂，多用于生理生化方面研究,培养液体菌种等。固体培养基凝固剂的量,琼脂冬季为1.5%-2.0%,夏季2.2%-2.3%。半固体培养基含有较少量琼脂(0.2%-0.5%)的培养基,使培养基未达到固态而呈粘稠状态。,粉状,条状,二、各级菌种的培养基（一）母种培养基,1、通用配方,营养液制作a准备工作,2、制作方法,b称量、材料预处理按配方准确称量各营养物质。将马铃薯去皮、挖掉芽眼后称量200g，切成1cm见方的小块。琼脂剪碎后用水浸泡。,c熬煮将切好的马铃薯块加适量水后放入锅中，煮至酥而不烂。,D、过滤、加可溶药物用双层沙布过滤，取滤汁，放在电饭锅中加入糖。,E、熬琼脂、定容在沸腾状态下加入琼脂，直到琼脂完全溶化为止，定容至1000ml。f、调节PH值。,营养液分装a用注射器分装b分装标准:分装量为试管长度的1/41/5。注意培养基不能沾污试管口。,c塞棉塞棉塞松紧适度，1/3在管外，2/3在管内。d扎捆7-10支试管捆在一起，棉塞上包好防水纸，直立放入高压灭菌锅中。,灭菌处理在1.01.5kg/cm2压力下维持20-30min。,摆斜面灭菌结束后锅盖开1/5的小缝，用余热烘干报纸和棉塞，然后摆斜面。斜面长是试管总长的1/2。,（二）原种、栽培种培养基制作,1、常见原种配方,木屑培养基配方细木屑80%，麸皮12%，玉米面1%，黄豆粉2%，过磷酸钙1.5%，红糖0.5%，尿素0.4%，硫酸镁0.1%，石灰1%，石膏2%，料：水=1：1.0-1.2。此配方适合香菇、黑木耳、平菇原种生长，菌丝粗壮洁白。玉米芯培养基配方玉米芯80%，麸皮14%，糖0.5%，过磷酸钙1%，石灰2%，尿素0.5%，玉米面2%，料：水=1：1.4-1.5。此配方适合于培养平菇原种，菌丝生长速度快，且菌丝粗状。,玉米芯、木屑混合培养基配方玉米芯42%，木屑20%，豆秸20%，麸皮10%，过磷酸钙1.5%，石灰2%，石膏1%，糖0.5%，玉米面3%，料：水1=1：1.4-1.5。此配方适合于培养平菇原种。生长健壮，也可培养金针菇，滑子蘑原种。软质木屑配方椴木屑75%（木线厂下脚料，颗粒较大），麸皮15%，玉米面5%，石膏1.5%，石灰1%，糖0.5%，过磷酸钙1.5%，尿素0.5%，料，水=1：1.2左右。适用于金针菇，滑子蘑等分解基质能力较弱的品种使用。,麦粒、木屑培养基配方新鲜、优质小麦80%，阔叶树木屑20%，木屑：水=1：1左右，拌木屑用煮小麦水，或在此基础上，加入总量0.5%的过磷酸钙，0.5%的蔗糖,1%的石灰，在麦粒煮好后连同木屑拌入。玉米粒培养基配方优质新鲜玉米100%，或后期加入0.5%过磷酸钙，0.5%的糖,1%的石灰。玉米粒培养基制作的原种，具备麦粒原种的优点，后劲更足，接种扩繁量更大。,2、原种培养基的制作方法谷粒培养基制作按配方称量各营养物质配方一：优质新鲜小麦65%，木屑15%，棉籽壳15%，麸皮5%，石膏1%，过磷酸钙0.5%，糖0.5%，尿素0.5%谷粒浸泡吸水冬季浸泡24-48小时，夏季加1%石灰（以防变酸）浸泡24小时，隔夜换水。,煮沸、沥干捞出泡好后，漂洗干净（去杂），煮至饱胀无白心，切忌煮开花，沥干水分后捞出。拌料用煮小麦水拌木屑、棉籽壳、麸皮，最后再一起与麦粒拌匀。,装瓶a.装料量应为1/3或1/2罐头瓶，便于培养时摇动基料促进丝均匀生长。b.擦净并封瓶口封口塑料袋采用规格为13cm13cm0.004cm高压聚丙稀袋，二层，里层在中央剪一3cm宽菱形口。至少二个皮套。,装锅灭菌高压灭菌于126左右维持2小时；常压灭菌于100维持10-12小时，夏季时间可酌情延长。出锅、冷却冷却至30以下待接种。,木屑、玉米芯料培养基制作方法按配方称料。拌料：干混（将石膏和不溶于水的主料和辅料混匀）；湿混（将石灰和溶于水的辅料制成母液，加入所需水量稀释后拌料）。,装瓶：闷1-2个小时（夏季时间不宜过长）待料充分吸足水后装瓶，装料至瓶肩，上紧下松，压平料面，擦净瓶口，打1.5cm粗接种孔至瓶底封口。灭菌：同谷料培养基制作出锅、冷却：同谷粒培养基制作,(三)栽培种制作制作方法基本同于原种制作。需要注意的是栽培种培养基制作一般选用丰富的培养料，而且含水量要较原种加大，更利于菌种快速吃料。容器可以用500ml罐头瓶，也可以用（17-18）X（30-35）X（0.04-0.05）cm低压聚乙烯袋。,栽培种的装袋,三、培养基的灭菌,（一）母种培养基的灭菌,无菌检验约30条件下空白培养23天,母基灭菌与摆斜面,（二）原种、栽培种培养基的灭菌,四、液体菌种制作技术（一）液体菌种制作的原理食用菌液体菌种制作是在发酵罐中，采用液体培养基通入无菌空气并加以搅拌，增加培养基中溶氧含量，提供食用菌菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，获得大量的菌丝体或代谢产物。,（二）液体菌种制作的特点1.原料来源广泛2.菌丝体生长快速3.生产周期短食用菌深层发酵一般仅需2-7d就可获得大量的菌丝体，而固体培养则需30-60d。4.工厂化生产、无季节性食用菌深层发酵是在发酵罐内、控制最佳条件来培菌体的，不受季节性限制。,（三）液体菌种制作的用途1、生产液体菌种食用菌经深层发酵2-7d的幼嫩菌丝体，可以用来作为食用菌栽培用的原种和栽培种。2、制备药物或提取生化制品许多食用菌种类，其深层发酵培养的菌丝体可作为提取药物成分或生化制品的材料。3、制作食品或畜禽饲料,（四）液体菌种制作的主要设备1.摇床往复式播床：振荡方式为来回振荡旋转式摇床：振荡方式为旋转,2.种子罐和发酵罐许多食用菌种类，其深层发酵培养的菌丝体可作为提取药物成分或生化制品的材料。,3.空气净化设备4.培养基连续灭菌设备包括配料罐、连消塔、维持塔、喷淋冷却器等。5供气设备主要是蒸气锅炉及附属设备,一、无菌操作二、母种的接种(一）分离法1.组织分离2.孢子分离（二）转管法三、原种、栽培种的接种,菌种分离将有价值的子实体的局部组织、孢子或基内菌丝移接到斜面试管培养基上，获得纯培养菌丝的操作称为菌种分离。菌种分离可以分为孢子分离、组织分离和菇木分离三种。,必备,母种转管无菌操作程序：1.将接种用品及原始母种放入接种箱内。2.用菇保1号、气雾消毒盒（2g/m3）或甲醛进行熏蒸，时间要在30分钟以上。3.手、台面、接种工具、试管用酒精棉球擦试消毒。4.点燃酒精灯，火焰灼烧接种镐至烧红后冷却，凡能伸进试管的杆部均过火灭菌。,5左手大拇指和其他四指并拢握住菌种管和待接试管，斜面向上，并保持水平。,6右手小指、无名指及手掌拔掉棉塞，用火焰灼烧试管口并不断搅动。,7先弃去前端1cm处，然后用接种镐快速移取黄豆粒大小的菌种入待接试管斜面培养基中央。,8灼烧试管口，并将棉塞在火焰上迅速过一下然后塞上。9用接种镐挑持住母种管，另一只手换待接管，重复上述操作。10收拾台面。11.贴标签,1.组织分离：采用食用菌子实体或菌核、菌索的任何一部分组织培养成纯菌丝体的方法。,（一）分离法,根据分离材料的不同，组织分离法可分为子实体分离法、菌核分离法以及菌索分离法。（1）子实体分离法采用子实体的任何部分如菌盖、菌柄、菌褶、菌肉进行组织培养，从而形成纯菌丝体的方法。,a伞菌组织分离法种菇的选择：头潮菇、外观典型、大小适中、菌肉肥厚、颜色正常、尚未散孢，无病虫害、长至七八分熟的优质单朵菇做种菇。种菇消毒：切取菇体基部，用75%的酒精溶液浸泡0.5-1min，再用无菌水冲洗2-3次。切块接种：纵剖（撕）菇体，尖头镊取柄盖交界处绿豆粒大的组织放入新斜面中部,培养纯化：适温下培养2-4天，可看到组织块上长出白色绒毛状菌丝体，移接到新的培养基上再经过5-7天适温培养，长满试管后即为纯菌丝体。出菇试验：将分离得到的试管种扩大繁殖，并移接培养成原种、栽培种,做出菇试验,选出出菇好、产量高、质量好的，即可作栽培生产用种。,b胶质菌类组织分离法：一种方法是将耳片反复用无菌水冲洗，切成0.5cm，小块移入培养基，于28下进行培养；另一种方法是剖取尚未展开耳片的耳基团内的组织块进行分离。,（2）菌核分离法：一些药用菌如茯苓、猪苓、雷丸都有菌核。进行组织分离时，采用含浆汁多的菌核。在无菌的条件之下，将菌核剖开，于菌核的附近，剖取蚕豆大小的菌核组织块移入斜面培养基上，在26-30下培养。,（3）菌索分离法：从菌索中分离培养得到纯菌丝体的方法。,.菌索分离,2、木腐菌基内菌丝分离把分离用菇木的部分或全部的表面在火焰上轻燎。取小刀在火焰上灭菌，对准菇木上菇柄（耳基）的着生位置切成两半。确定欲分离菌丝在菇木上的位置，再次用火焰灭菌过的小刀，在欲分离部位刻划数个井字。用火焰灭过菌的接种钩，钩取一小块木屑（绿豆大小或更小）移接于斜面培养基。接种后将试管置于2527下培养，促使其恢复。近风干的种木内菌丝常处于休眠状态。接种后，种木吸湿，菌丝逐渐恢复生长。如果短期时间内分离物未曾发，则可保留至4周后，再断定分离是否成功。,3.孢子分离(有性繁殖）孢子分离主要是指利用子实体上产生的成熟有性孢子分离培养获得纯菌种的方法。分为多孢分离与单孢分离两种。,多孢分离,单孢分离的菌落,2.采收孢子,钩悬法生产上采集木耳、银耳的孢子常采用此法。,25、24h现孢子粉取出分离材料,孢子印法取成熟的伞菌或胶质的子实体，经表面消毒，切去菌柄，菌褶向下，放置于灭过菌的有色纸上（红、黑、蓝、白），用通气钟罩上，静置一天（20-24），孢子落在纸上，形成孢子印，再从中挑取少量孢子转入试管培养基上培养。,空中孢子捕捉法:伞菌的孢子大量弹射时，子实体周围可以看到“孢子云”，可以在其漂去的上方倒放琼脂平板，使孢子附在其上，再盖上盖，用塑料胶水纸封好培养，整个过程要快。褶上涂抹法:取成熟伞菌，切去菌柄基部，带入接种箱内，先表面消毒，用接种针插入两片菌褶之间，轻轻抹过表面，然后用划线法涂抹于试管培养基上。,帖褶法:取一小块成熟的菌褶或菌盖，用熔化的琼脂或胶水、糨糊之类，帖附在试管斜面的正上方试管壁上或培养皿皿盖上，经6-12小时，待孢子落下后，立即把试管或培养皿中的培养基转到另一消毒过的空白试管或培养皿中进行培养。,接种孢子,用接种环蘸孢子液或孢子粉涂布于平板上,（二）转管法,转管,三、原种、栽培种的接种,接栽培种,用接种匙（镊、铲）取枣大原种放于袋的两端或瓶中料面上,栽培种接种,一、母种培养,第六节菌种的培养,1、温度控制菌种培养过程中，瓶温会比室温高24。随着菌龄增加，瓶温会逐渐下降，但仍比室温高。一般培养初期温度控制在该菌最佳生长温度，随后每隔10天降低1，长满瓶后，尽可能将温度调低。2、湿度控制：梅雨季节，降低RH；冬季需提高RH（挂湿布或拖地板）。3、通风,4、光：营养菌丝培养阶段，培养室尽可能地暗。5、酸碱度比最适PH值略高1.5。后期管理中可以用1%-2%的石灰水喷洒菌床，以防PH值下降。6、培养时间控制菌龄（即将长满斜面）。培养时间过长菌种容易衰退。7、污染的检查及时挑拣污染管,母种培养,返回本节,第七节菌种质量的鉴定,菌种鉴定主要包括两个方面的内容：一方面要鉴定未知的菌种，从而避免菌种混乱带来得损失；另一方面鉴定已知菌种质量的好坏，从而选出优良品种，夺得食用菌的丰产。,、,一般从菌种的纯度、长势、颜色、菌龄、均匀度和出菇快慢等6个方面进行鉴定。,（一）母种质量的鉴定,一般分离培养以及引进的母种，都应严格控制转管的次数，最多不要超过5次。同时要考虑其菌龄，随着培养时间的延长，菌龄越来越大，生活力随之降低，菌种老化。母种质量标准：,好母种,2.鉴定,耐干湿性试验,耐高温性试验,出菇试验,外观肉眼鉴定,肉眼观察包装是否合乎要求，棉塞有无松动，试管有无破损，有无病虫害等。外表菌丝洁白、粗壮、富有弹性、则生命力强。如有淡茶褐色的菌膜及子实体，只要接种时去除就可以用，若菌丝已干燥、收缩或菌丝体自溶产生大量红褐色液体，则表明生活力下降，不能作为菌种。,菌丝生长速率测定,将所获的菌种，转接至PDA培养皿中央,待菌丝生长蔓延时,用直径0.5cm的打孔器,经灭菌后打取边缘菌丝,连同培养基重新接入PDA培养皿中央进行培养,每隔24小时,测定菌落直径,直至菌落覆盖全皿为止,从而计算出菌丝平均生长速度。,显微镜检查,在载玻片上滴一滴蒸馏水，然后挑取少许菌丝置水滴上，让菌丝体充分展开，盖好玻片，在显微镜下观察。蘑菇菌丝体应粗壮，菌丝节较长，呈分枝状，说明是正常菌种，如果菌丝节很短，分枝很浓密，菌丝较纤细，生长缓慢，一般为不正常菌种。,液体培养鉴定,配制2糖水溶液，经常规灭菌消毒，挑取黄豆粒大的菌块，放入100毫升上述溶液中，置于25-28温度下培养3-7天后，若液面出现气泡，产生“油皮”，发生浑浊现象，说明菌种本身有杂菌；如果苗块下沉，或迟迟才长出很薄的菌丝层，则说明菌种生活力弱；如若液面四周的菌丝生长快，且浓白呈棉絮状，则表明菌种生命力强。,菌种纯度测定,随机抽取经初步检测的菌种，挑取菌种不同部位菌丝连同培养基转接到PDA培养基的培养皿，每瓶菌种转接30-50点，25培养，观察菌种萌发时有无杂菌和异常生长状况出现。,吃料能力鉴定,将试管母种接入新鲜配制的装在试管中的粪草培养基中，置24下进行培养,5天后观察菌丝生长情况,如果菌种块能很快萌发,并迅速向培养料中生长伸展,则说明该品种的吃料能力强;如果菌种萌发后生长缓慢,迟迟不向四周和料层深处伸展,则表明该品种对培养料的适应能力差,是劣质菌种。,（二）原种、栽培种质量的鉴定好的原种和栽培种的标准：1、母种的转管次数用转管次数4-5次以内的母种生产的原种和栽培种。2、菌龄一般食用菌的原种和栽培种，在20左右可保存3个月，超过上述菌龄的菌种就已经老化，不应用于生产。,3、原种和栽培种的外观要求（1）菌丝生长健壮，绒状菌丝多，生长整齐。（2）菌丝已长满培养基，银耳的菌种还要求在培养基上分化出子实体原基。（3）菌丝色泽洁白或符合该菌的颜色（4）菌种瓶内无杂色出现和杂菌污染（6）菌种培养基不能干缩与瓶壁分开,4、常见优质原种和栽培种的优良性状,（1）平菇菌丝粗壮，浓白，密集，爬壁力强，菌柱断面菌丝浓白，清香，无异味，发菌快，为优质菌的性状。（2）猴头菌丝洁白，细绒毛状，紧贴培养基放射状生长，程星芒状或点片状，后期在培养基上产生珊瑚状子实体原基，培养基的颜色常变为淡棕褐色。（3）金针菇菌丝洁白，较粗壮，密集，长绒毛状，外观似细粉状，培养基后期菌种表面易产生菇蕾。,（4）香菇菌丝洁白，绵毛状，后期见光后易分泌出酱油色的液体，呈褐色，有时表面产生小菇蕾。（5）木耳菌丝洁白，密集，棉绒状，短而整齐，全瓶发育均匀，有时瓶壁间出现淡褐色、褐色、浅黑色的梅花状胶质即子实体原基。（6）银耳银耳菌丝与香灰菌丝按比例混合培养。羽毛状菌丝生长健壮，成束分布，黑疤多，分布均匀，无其他杂斑。同时银耳菌丝吃料较深，瓶内有发白的棉毛团或耳片。,（7）草菇菌丝呈透明状，白色或黄白色，分布均匀，常有大量的红褐色的后垣孢子堆。（8）双孢蘑菇菌丝灰白带微蓝，密集，细绒状，气生菌丝少，贴生菌丝的培养基内呈细绒状分布，发菌均匀，有特有的双孢蘑菇的香味。,（9）灵芝菌丝白色，密集，以接种点为中心，呈辐射状向四周生长，接种点菌丝常呈蛋黄白色，菌丝贴生于培养基表面，易形成菌膜。（10）滑菇菌丝洁白，密集，棉絮状，上下分布均匀，用手指按菌种柱有弹性，菌柱的断面呈白色或橙黄色，颜色均匀一致，用手捏碎成大块而不是粉末。,产生原基,黄水,污染,第八节菌种保藏与复壮,一、菌种保藏（一）保藏目的及原理（二）常用保藏法（三）保藏注意二、菌种复壮(一）菌种的衰退（二）复壮方法（三）防衰措施,一、菌种保藏,（一）保藏目的及原理,目的,（二）常用保藏法,以母种形式保藏,1.斜面低温法斜面菌种置，46冰箱中（36个月），最好在2-3个月时转管一次。,返回本节,2、液体石蜡油保藏法,无菌检验,吸取液体石蜡,4、滤纸保藏0.5cm1.0cm滤纸条收集孢子印投入指形管，同时投入硅胶12粒，塞上软木塞后用石蜡封口。要无菌操作，硅胶要干热灭菌。,3.自然基质保藏法,麸皮保藏法：称取一定量的麸皮加水或营养液后拌匀即可使用。水、麸皮装入试管，高压灭菌后接入菌种，放在适温下培养。菌丝体发育好后，将试管放入干燥室温下进行干燥。干燥后放在20以下干燥处保藏，可保藏35年时间。麦粒保藏法：取优质小麦，淘洗后浸入20水中泡5小时，稍加晾干，装管。装入量以管长的14到13为宜，灭菌，趁热摇散，冷却后接入菌丝体，适温培养至大多数麦粒上出现稀疏菌丝时终止培养。置于25以下干燥处，可保藏12年。,4.菌丝球保藏法：将菌种接入马铃薯培养液中，每250毫升三角瓶装60毫升培养液，振荡培养或每天摇动510次，培养57天，然后将形成的菌丝球移入装有5毫升无菌生理盐水的试管中，每管约移入45个菌丝球，塞上棉塞，用蜡封好管口，置低温下，可保藏1年。,5.滤纸保藏法将蘑菇孢子吸附在滤纸条上，干燥后放入冰箱进行保藏，由于该保藏是有性的孢子，一般不用于生产中，主要是起到保藏种质资源的作用及菌种的选育，用该方法已保藏蘑菇菌种达10年以上,孢子成活率约为50-80%之间。,6.真空冷冻干燥保藏法真空冷冻干燥简称冻干。这种方法是将菌种同时处于低温、干燥和缺氧的条件下，使菌种的代谢活动相对静止。方法是：将要保藏的菌种或悬浮液，装在安瓿瓶里，骤然冷却，立即抽真空，使其升华脱水而干燥，在熔封后，置于低温或是室温下保藏。,7.液氮超低温保藏法液氮超低温保种是把菌种装在