高效液相色谱讲义.ppt

高效液相色谱方法概述（HPLC，HighPerformanceLiquidChromatography）撰稿人：姚剑合肥市八骏仪器有限公司HEFEIBAJUNINSTRUMENTSCO.,LTDTEL2166730手机Q：693229762,色谱分析法的原理,从茨维特的实验中得出这样的结论:色谱分析法是一种物理分离方法,其分离原理是将被分离的组分在两相间进行分布,其中一相是具有大表面积的固定相(CaCO3),另一相是推动被分离的组分(色素)流过固定相的惰性流体(石油醚),叫流动相。当流动相载带被分离的组分经过固定相时,利用固定相与被分离的各组分产生的吸附(或分配)作用的差别,被分离的各组分在固定相中的滞留时间不同,使不同的组分按一定的先后顺序从固定相中被流动相洗脱出来,从而实现不同组分的分离。,色谱基本理论,色谱图：色谱柱流出物通过检测器时所产生的相应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间；色谱峰：色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号的变化曲线；基线：在正常操作条件下仅有载气通过检测器时所产生的信号曲线；峰底：连接峰起点与终点之间的直线；,峰高：从峰最大值到峰底的距离；峰（底）宽：从峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离；半峰宽：在峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交点间的距离；峰面积：峰与峰底间的面积；基线漂移：基线随时间的缓慢变化；基线噪声：由于各种因素引起的基线波动；拖尾峰：后沿较前沿平缓的不对称峰；前伸峰：前沿较后沿平缓的不对称峰；假峰：并非由样品本身产生的色谱峰；保留时间：样品组分从进样到出现峰最大值所需的时间，即组分被保留在色谱柱中的时间；死时间：不被固定相保留的组分的保留时间；调整保留时间：即扣除了死时间的保留时间；死体积：即对应于死时间的保留体积；,峰面积的计算,分离度,w1,w2,TR2,TR1,当R1时，两峰重叠，没有分离开，当R=1时，两峰的面积有5%的重叠，即两峰分开的程度为95%，当R=1.5时，分离程度可达99.7%，可认为达到基线分离。,色谱分析法的分类,按两相的状态分类,按固定相性质和操作方式分类,按分离过程的物理化学原理分类,高效液相色谱法的特点,分离效能高检测灵敏度高分析速度快选择性高,高效液相色谱法的应用范围,高效液相色谱法适于分析沸点高、相对分子质量大，受热易分解的不稳定有机化合物、生物活性物质以及多种天然产物，这些化合物约占全部有机化合物的80%，可应用于化工生产、制药工业、食品工业、生物化工、医学临床检验和环境监测等领域。,高效液相色谱法的局限性,高效液相色谱法中缺少通用型检测器；高效液相色谱法中需使用很多溶剂，成本比气相色谱法高，许多有机溶剂是有毒易挥发的，易对环境造成污染；高效液相色谱法不能替代气相色谱去完成要求柱效达10万块理论塔板数以上的，组成复杂的石油样品分析，也不能替代中、常压色谱法去分析受压易分解、变性的生物活性样品。,高效液相色谱仪,贮液罐,泵,进样器,色谱柱,检测器,数据处理机或工作站,样品,高效液相色谱仪的结构,输液系统（包括贮液罐及脱气装置、高压输液泵、梯度洗脱装置）进样系统色谱柱系统检测系统数据处理系统连接管路,输液系统,贮液罐及脱气装置贮液罐一般由玻璃、不锈钢或特种塑料制成，容积约为0.52.0L，贮液罐应具备以下条件：足够的容积；与流动相不发生化学反应；便于贮存的流动相脱气；与其它部件联接方便。,输液系统,贮液罐及脱气装置流动相进入高压输液泵前必须脱气，否则溶解在其中的气体会在流动相进入检测器时释放出来，造成基线不稳，检测器噪声增大。常用的脱气方法有以下几种：低压脱气法（易使低沸点溶剂挥发影响组成，不适于二元以上溶剂脱气）吹气脱气法（向流动相中吹入惰性气体）超声波脱气法,输液系统,高压输液泵高压输液泵用以对柱子提供流动相，要求：泵体材料能耐化学腐蚀，通常使用普通耐酸不锈钢或优质耐酸不锈钢，为防止酸、碱缓冲溶液的腐蚀，在离子色谱或亲和色谱分析中现已使用由聚醚醚酮材料制成的高压输液泵；能在高压下连续工作，通常要求耐压4050MPacm-2，能在824小时连续工作；输出流量范围宽；输出流量稳定，重复性高；,输液系统,高压输液泵工作方式：恒压（注射型泵、往复型泵）恒流（气动放大泵）,恒流泵（注射型）,注射型泵又称注射式螺杆泵，它利用步进电动机（1）经变速齿轮箱（2）螺杆（3）传动、带动活塞（4）以缓慢恒定的速度移动，使载液在高压下以恒定的流量从（6）输出，当活塞达到每个输出冲程的末端时，暂进停止输出流动相，然后以极快的速度进入吸入冲程，再次将流动相由单向阀（7）封闭的载液入口吸入泵中，再重新进入输出冲程的运行。如此往复交替进行。,注射式螺杆泵的优缺点,优点：流量精确；通过控制电压来改变流量，与系统阻力无关；缺点：由于液缸容积有限，每次流动相输完后，需重新吸入流动相，当流量很大时，中断频繁；由于高压工作，故对活塞与液缸间的密封要求高，更换溶剂不方便。,恒流泵（往复型泵）,往复型泵又分为柱塞式和隔膜式两种。柱塞式往复泵由电动机带动凸轮转动，再用凸轮驱动一活塞杆作往复运动，通过单向阀的开启和关闭，定期将贮存在液缸里的液体以高压连续输出，以改变电动机的转速来调节活塞冲程的频率，从面调节流量。隔膜式往复泵与柱塞式不同只是流动相接触的不是活塞，而是具有弹性的不锈钢或聚四氟乙烯隔膜。,柱塞式往复泵的优缺点,优点：可在高压下连续大量输液；由于泵的液缸容积小，其柱塞尺寸小易于密封，柱塞、单向阀的阀球和阀座使用人造红宝石材料制成；缺点：输出流动相虽然连续、恒流量，但存在脉动；柱塞直接与流动相接触造成污染；长期运转，因流动相含有机械杂质会造成单向阀的阻塞，或对密封部件产生磨损。,恒压泵（气动放大泵）,气动放大泵采用压缩空气作为动力去驱动气缸中横截面大的活塞，再经过一个连杆去驱动液缸中横截面小的活塞，当系统阻力不变时可保持恒定流量，当系统阻力变化量，就不能保持恒定的流量了。,恒压泵的优缺点,优点：能以较简单的方式建立高压并输出无脉动的恒压流动相液流；可用改变气源压力的方法来调节载液流速；缺点：不能输出恒定流量的流动相；不易测出重复的保留时间；不能获得可靠的定性结果；由于泵的液缸体积大，更换载液时操作不方便。,输液系统,梯度洗脱装置流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，以调节它的极性，使样品中每个组分都有较高的分离度，从而实现各组分的圆满分离，梯度洗脱可提高柱效，缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于气相色谱的程序升温技术。梯度洗脱可分为低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）两种方式。,输液系统,梯度洗脱装置（低压梯度）如图：在低压梯度中，不同的溶剂（A、B）由程序器（1）中已编辑好的程序控制，经电磁比例阀（2）进入混合室（3）混合，再由高压输液泵（4）打入色谱柱（5）。,A,B,1,2,3,4,5,输液系统,梯度洗脱装置（高压梯度）如图所示，在高压梯度中，不同溶剂（A、B）由梯度编程器和控制器（3）控制高压输液泵（1）和高压输液泵（2）以不同的比例进入混合器（4）混合，最后进入色谱柱（5）。,A,B,1,2,3,4,5,低压梯度和高压梯度的比较,低压梯度变化呈台阶式，当每个台阶很小时，可接近连续变化，低压梯度只需一个高压输液泵结合一个电磁阀就可完成多元梯度洗脱，较高压梯度洗脱成本大大降低，而且溶剂混合后再由高压输液泵输入色谱柱，它可以减少溶剂可压缩性的影响，并能完全消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化所带来的流量的波动。高压梯度可实现任意形式的梯度洗脱曲线，易于实现自动化，不同的溶剂在高压下混合，不易产生气泡，对溶剂混合后脱气要求较低，但高压梯度需使用多台高压输液泵，成本较低压梯度高，溶剂的可压缩性及混合时引起的热力学体积变化可能影响输入到色谱柱中的流动相的组成。,进样器,注射器进样装置六通阀进样装置自动进样装置,注射器进样装置,当色谱柱的操作压力超过去15MPa时，带压操作会引起流动相的泄漏，所以只能采用停流进样技术，即进样前先打开泄流阀，使柱前压降至常压，再用注射器进样，然后关闭泄流阀，完成一次进样。,六通阀进样装置,色谱柱,柱材料常用内壁抛光的不锈钢管柱规格常用的柱规格有：内径：4.6mm或3.9mm柱长：150mm或250mm,固定相,液固吸附色谱全多孔硅胶（无定形YWG、球形YQG）全多孔堆积硅球（YDG）薄壳硅球（YBK）全多孔球形氧化铝高交联度苯乙烯二乙烯基苯共聚微球（YSG）,固定相,液液分配色谱采用化学键合固定相，其以全多孔球形硅胶YQG（或全多孔无定形硅胶YWG）作载体，与端基含有十八烷基（C18H37）、醚基（ROR）、苯基（C6H5）、胺基（NH2）、腈基（CN）的硅烷偶联剂进行化学键合，制成非极性的十八烷基键合固定相（ODS），弱极性的醚基、苯基键合固定相，极性的胺基、腈基键合固定相。,流动相,液固吸附色谱对于使用硅胶、氧化铝等极性固定相的色谱柱，其相应的流动相以弱极性的戊烷、已烷或庚烷作主体，适当加入氯仿、二氯甲烷、乙腈、甲醇等改性剂；对于使用苯乙烯-二乙烯基苯高交联共聚微球等非极性固定相的色谱柱，其相应的流动相以水或甲醇作为流动相的主体，适当加入乙腈、四氢呋喃等改性剂。,流动相,液液分配色谱当固定相为十八烷基非极性键合固定相（ODS）或醚基、苯基弱极性键合固定相，选用的流动相应以强极性的水作为主体，加入甲醇、乙腈等作为改性剂，此种方法亦称为反相色谱；当固定相为强极性胺基、腈基键合固定相，选用的流动相应以弱极性的正已烷作为主体，加入氯仿、乙醚等作为改性剂，此种方法亦称为正相色谱；,检测器,理想的检测器具有下列特征：灵敏度高对所有的溶质都有快速响应响应对流动相流量和温度变化都不敏感不引起柱外谱带扩展线性范围宽适用的范围广,检测器的分类,按检测对象分类整体性质检测器：检测从色谱柱中流出的流动相总体物理性质的变化情况。这种检测器测定灵敏度低，易受温度和流量波动的影响，不适合于痕量分析和梯度洗脱，（如折光指数检测器RID、电导检测器ECD）；溶质性质检测器：只检测柱后流出液中溶质的某一物理或化学性质的变化情况。这种检测器灵敏度高，对流动相流量和温度变化不敏感，可用于痕量分析和梯度洗脱，（如紫外检测器UVD、荧光检测器FD）。,检测器的分类,按适用性分类选择性检测器：这种检测器对不同组成的物质响应差另极大，只能选择性的检测某些物质，（如UVD、FD、ECD）；通用型检测器：它对大多数物质的响应相差不大，几乎适用于所有物质，（如RID，但它灵敏度低，受温度影响波动大）。,紫外吸收检测器（UVD）,紫外吸收检测器是高效液相色谱仪中使用最广泛的一种检测器，根据不同的结构可分为：,固定波长检测器可变波长检测器二极管阵列检测器,固定波长检测器,如图所示：由低压汞灯（1）发出的紫外光经入射石英棱镜（2）准直，再经遮光板（3）分为一对平行光束分别进入流通池（4）的测量臂和参比臂，经流通池吸收后的出射光，经过遮光板（5）、出射石英棱镜（6）及紫外滤光片（7），只让254nm或280nm的紫外光被双光电池（8）接收，双光电池检测的光强度经对数放大器转化成吸光度后，经放大器输送至记录仪。其中9,10,11,12分别为测量池和参比池的入口和出口。固定波长紫外吸收检测器，由低压汞灯提供固定波长为=254nm或=280nm的紫外光；此检测器结构紧凑、造价低、操作维修方便、灵敏度高适于梯度洗脱；,可变波长检测器,如图所示：由氘灯光源（1）发出的光经聚光透镜（2）聚焦，由可旋转组合滤光片（3）滤去杂散光，再通过入口狭缝（4）至平面反射镜（5），经反射到达光栅（6），光栅将光衍射色散成不同波长的单色光，当某一波长的单色光经平面反射镜（7）反射至光分束器（8）时，透过光分束器具的光通过样品流通池（10），最终到达检测样品的测量光电二极管（11），被光分束器反射的光到达检测基线波动的参比二极管（9），当获得测量和参比光电二极管的信号差，即为样品的检测信息。,光二极管阵列检测器,如图所示：钨灯（1）灯丝的影像通过偶合透镜（2）聚焦在氘灯（3）的放电处，从而在光学上把两个光源结合在一起，使它们发出的光共用一个光轴进入消除色差透镜（4）聚焦后，经光闸（5）和光学透镜（6）照射到流通池（7）上，出射光透过光学透镜（8）和出射狭缝（9），经全息凹面衍射光栅（10）色散后，投射到一个由1024个二极管组成的二极管阵列上而被检测。此光路中光闸是唯一运动的部件，它有三个动作位置：A光闸将入射光束全部遮挡，以进行暗电流补偿；B将氧化钬滤光片插入光路，对衍射后的波长进行精确校正；C打开光闸使入射光通过样品流通池照在光栅上。光二极管阵列检测器，它与普通紫外检测器的区别在于进入流通池的不再是单色光，获得的检测信号不是单一波长上的，而是在全部紫外光波长上的色谱信号，它不仅可进行定量检测，还可提供组分的光谱定性的信息。它使用“反置光学系统”。,折光指数检测器（RID）,如图所示：由钨丝光源（1）发出的光经遮光板（2）、外滤光片（3）、遮光板（4）后，形成两束能量相同的平行光，再经透镜（5）分别聚焦至测量池和参比池上，透过空气-三棱镜（6）界面、三棱镜液体界面的平行光，由池底镜面折射后再反射出来，再经透镜（7）聚焦在双光电管（8）上，信号经放大后，送入记录仪记录。折光指数检测器又称示差折光检测器（DRD）它是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定试样浓度的检测器。折光指数检测器按工作原理可分为反射式、干涉式、偏转式三种，其中干涉式造价昂贵使用较少，偏转式池体积大（约10ul），但可适用于各种溶剂折射率的测定，反射式池体积小（约3ul），应用较多，但当测定不同的折射率范围的样品时（通常折射率分为1.31-1.44和1.40-1.60两个区间），需要更换固定在三棱镜上的流通池。,电导检测器（ECD）,如图所示：ECD主体由不锈钢压板（1）和聚四氟乙烯绝缘层（2）包裹，中间是由玻璃碳（3）、（5）或铂片制成的导电正极（4）和负极（6），两电极间用0.05mm厚的聚四氟乙烯薄膜（9）分隔开，薄膜中间开一长条形孔道作为流通池，当流动相中含有的离子通过流通池时，会引起电导率的改变，正负电极构成交流电桥的臂，电桥产生的不平衡信号，经放大、整流后输入记录仪。电导检测器用于检测阳离子或阴离子，其在离子色谱中获得广泛应用，由于电导率随温度变化，因此测量时要保持恒温，在使