蛋白质相互作用PPT课件VIP

.,1,Protein-proteinInteraction蛋白质-蛋白质相互作用,03/27/2009,.,2,Protein-ProteinInteractions-ACommonThemeinCellBiology蛋白质-蛋白质相互作用细胞生物学领域的普遍主题,.,3,*DNA*RNA*Protein,Cellassemblyandfunction/细胞组装与功能,Messenger,Headquarter,Executor,Stable,DNAmutation,Stable/Versatile,rRNA,tRNA,mRNA,Versatile,ProteinmodificationProtein-ProteininteractionProtein-Othercomponentinteraction,Protein-ProteinInteractions,.,4,SingleproteinProteincomplexProteincomplexinteractionProteincomplexnetworkCell,Versatile,Dynamic,Accurateregulation,Cellassemblyandfunction,Protein-ProteinInteractions,.,5,InteractionDomain-Structuralbasisforproteininteraction相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础,*信号蛋白，调节蛋白以及大多数其他的蛋白质都具有包括相互作用区域在内的好几个结构域；*有些多肽仅由相互作用区域组成，从而充当蛋白质复合物的核心。,.,6,InteractionDomain-Structuralbasisforproteininteraction相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础,*SH2domain:phosphotyrosine-containingpeptidesrecognitiondomain。SH2分布最为广泛，识别特定的含有磷酸化Tyr的多肽模块。,SH3,SH2,Ykinase,SH3,SH2,SH3,pYEEI,pYVNV,SrcSH2domain:Grb2SH2domain:,.,7,InteractiondomainandProteininteractionSignalingtransductionpathway,.,8,PhysiologicalfunctionsofproteininteractionsLocalization蛋白质的亚细胞定位,*蛋白质的亚细胞定位与其功能密切相关；*涉及：蛋白质-蛋白质相互作用；蛋白质与磷脂的相互作用；*蛋白质的组织特异性与亚细胞定位的研究是蛋白质功能研究的起始步骤,.,9,Protein-proteininteractioncanbeusedtobuildcomplexbiologicalsystems.蛋白质-蛋白质相互作用是功能复合物形成的基础。（如线粒体内膜呼吸链）,PhysiologicalfunctionsofproteininteractionsLocalizationandTrafficking,.,10,Aberrantinteractionscancontributetopathogenesis;错误的相互作用可能导致病理形象的出现。如Alzheimersdisease,beta-淀粉样结构的堆积；,PhysiologicalfunctionsofproteininteractionsLocalizationandTrafficking,.,11,Inducibleproteininteraction细胞面对不断改变的环境表现出来的动态行为有赖于蛋白质的翻译后修饰以及它带来的蛋白质相互作用的变化。,.,12,Techniquesandcomputation,ElucidationofProtein-ProteinInteractions,BiophysicalTechniquesMassSpectrometrySurfacePlasmonResonanceAtomicForceMicroscopyNMRX-rayCrystallography,HighThroughputTechniquesLibraryScreeningDegeneratePeptideLibrariesSpotBlotsCo-IPsGST-pulldownsYeast2-HybridPhageDisplay,StandardTechniquesCo-IPsGST-pulldownsYeast2-HybridPhageDisplay,InvivoImagingFRETBRET,ProteinInteractionNetworks,.,13,Techniques：Principle,Process,AdvantageandDisadvantageGST-Pulldown,Principle:AffinitypurificationAffinitybetweenInteractionmotif/polypeptideanditsinteractionproteins;Advantage:Directinteraction/InvitroProcess:,Interactionmotif,GST,ImmobilizedonGlutathionebeads,AffinitycolumnMaking,Affinitypurificationfromtissueorcelllysate,.,14,Techniques：免疫沉淀,.,15,质量作用定律决定IP的成功度,.,16,Techniques：免疫沉淀（非变性）,免疫沉淀的灵敏度取决于ProteinA(orG)与IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度；,ProteinABead,IgG,Antigen,Kd,Kd,*,*,IgG,Kd,Antigen,.,17,Co-Immunoprecipitation/共免疫沉淀,Principle:Affinitypurification/亲和纯化Advantage:Invivo(Physiologicalstatus)/代表生理状态下的相互作用,X,Y,X,Y,Cell,CellLysisandImmunoprecipitationofproteinX,Z,Z,细胞裂解与蛋白质X的免疫沉淀,.,18,Techniques：免疫沉淀（非变性）,生理活性的保持：a.全程低温操作；b.裂解液中加入蛋白酶抑制剂；2.免疫沉淀的灵敏度取决于ProteinA(orG)与IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度；,ProteinABead,IgG,X,Kd,Kd,*,*,IgG,X,Kd,.,19,Techniques：免疫沉淀（非变性）,免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时，*需要去除盐的干扰，PBS或其它洗涤缓冲液应可能去除；大量IgG掺入也影响电泳的效果，如脱尾和扩散。检测信号十分微弱时，这种条带的扩散可能导致根本无法获得信息；,.,20,Techniques：免疫沉淀（非变性）,免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时，大量的IgG掺入样品后导致免疫印迹时出现非特异性条带；对免疫共沉淀的结果分析影响尤其大；,IgG,目的蛋白,用目的蛋白的抗体进行免疫沉淀，再用免疫印迹法进行检测；,.,21,GFP,WT,YFMut(6),-+,-+,-+,IP:GFPIB:4G10(pTyr),MTSS1-GFP,GFP,PDGF,115,93,49.8,35.8,29.2,198,-+,-+,-+,Reblot:GFP,MTSS1-GFP,GFP,WT,YFMut(6),.,22,Techniques：免疫共沉淀（非变性）,操作同非变性免疫沉淀，只是检测的是相互作用蛋白；其效率还涉及复合物中蛋白质X，Y，Z的Kd值。,ProteinABead,IgG,X,Y,Z,ProteinAIgGProteinX*ProteinYProteinZ,Kd,Kd,Kd,Kd,.,23,Techniques：免疫共沉淀（非变性）,1.免疫复合物中蛋白质X，Y，Z的Kd值越小，即越稳定，有利于免疫共沉淀的进行;2.免疫沉淀中提高灵敏度的方法同样适用于免疫共沉淀；,X,Y,Z,ProteinAIgGProteinX*ProteinYProteinZ,Kd,Kd,Kd,Kd,.,24,Techniques：免疫共沉淀（非变性）,细胞裂解液的几点考虑：1.复合物的稳定，提高灵敏度，但会降低特异性；2.针对特定的复合物，细胞裂解液中可能加入磷酸酯酶抑制剂或者ATP及一些金属离子以维持复合物的稳定；,.,25,Techniques：免疫共沉淀,免疫共沉淀中的非特异性：,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,X,Y,X,Y,B,A,X,.,26,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型I）,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,A,X,原因：抗体的非特异性,.,27,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型I）,1.抗体的质量：抗体的特异性；2.尽可能的设置多种阴性对照；一般采用兔子免疫前的血清(pre-immuneserum)同时进行免疫沉淀及后续分析;3.使用目标蛋白的多种抗体进行免疫沉淀并比较；4.采用不表达目标蛋白的细胞裂解物同时进行免疫沉淀并比较；5.增强细胞裂解液的严谨性，降低非特异性；6.检测两种蛋白质的相互作用时，同时用两个蛋白质的抗体进行实验；,.,28,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,X,Y,X,Y,B,X,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型II）,抗原复合物与其它蛋白质的非特异性相互作用；抗原复合物解离,X,.,29,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型II）,*当X-Y的复合物不很稳定或解离常数大时，可以考虑使用细胞可渗透的交联剂(Cross-linker),X,NH2,Y,NH2,活性基团,活性基团,A,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,.,30,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型II）,*当X-Y的复合物是瞬间形成的或解离常数大时，可以考虑使用细胞可渗透的交联剂(Cross-linker),X,NH2,Y,NH2,活性基团,活性基团,A,.,31,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,X,Y,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型II）,.,32,研究方案:AffinitypurificationMattilaetal,JBiolChem,278,8452,2003;Bompardetal,JCellSci,118,5393,2005.Linetal,Oncogene,24,2059,2005.,.,42,利用亚细胞定位及蛋白质相互作用等信息进行蛋白质功能归属,例1：从免疫共沉淀中得到的蛋白质中筛选重要功能相关蛋白：利用免疫共沉淀方法找到的9个p53(胞浆和核定位）结合蛋白1.GRP-94GRP-942.Alpha-actinin1GRP-78分子伴侣*3.MCM3GRP-754.GRP-785.GRP-752MCM3DNA复制准许因子*6.LaminA/C7.Ezrin/CytovillinAlpha-actinin胞浆8.CD98antigen3LaminA/C核纤层细胞骨架？9.ProteinkinaseCEzrin/cytovilin胞浆4ProteinKinaseC激酶？5CD98antigen跨膜糖蛋白X,1,.,43,例3Sra1与Nap