高效液相色谱法培训课件

高效液相色谱，高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代后期在经典液相色谱的基础上发展起来的一种分离和分析方法，介绍了气相色谱的理论和实验方法。流动相由高压泵输送，采用高性能固定相和在线检测。与气相色谱法相比，该方法具有适用范围广、样品预处理简单、分离效率高、流动相选择范围广、检测方法无损、出水成分可回收等优点。第一节概述了高效液相色谱、液-固吸附、液-液分配、正相色谱反相色谱、通用反相色谱离子对色谱离子抑制色谱、离子交换色谱、通用离子交换色谱离子色谱氨基酸分析、空间排阻色谱、凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱、假相色谱、胶束色谱环糊精色谱、亲和色谱、手性色谱、毛细管电泳、键合相色谱、流动相极性小于固定相极性的正相色谱分布色谱，称为正相分配色谱。常用的分析柱包括：氨基柱、氰基柱和硅胶柱。常见的流动相是极性小的有机溶剂。反相色谱(反相高效液相色谱)流动相极性大于固定相极性的分布色谱称为反相高效液相色谱。常用的分析柱有消耗臭氧层物质(C18)、C8和C2。常见的流动相是甲醇-水、乙腈-水。离子抑制色谱调节流动相的酸碱度，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，达到分离有机弱酸和弱碱的目的。离子配对色谱法)将反离子加入到流动相中，并与解离状态的分析物反应，生成脂溶性中性离子对复合物，从而增加分析物在非极性固定相中的溶解度，提高分离效果，达到分离目的。常用的抗衡离子包括：季铵盐为酸性烷基磺酸盐为碱性。离子色谱是从经典离子交换色谱发展而来的液相色谱技术，它利用物质在离子交换柱上迁移的差异实现分离，用于测定亲水性阴离子和阳离子。根据是否使用抑制柱，可分为抑制离子色谱和非抑制离子色谱。空间排阻色谱(stericexclusion)也称为凝胶色谱，它根据分离组分的分子大小和凝胶空隙直径大小之间的相对关系进行分离，类似于分子筛的作用。在一定的分子线圈尺寸内，分子越大，保留时间越短。凝胶渗透使用有机溶剂作为流动相，凝胶过滤使用水溶液作为流动相，其分子大小与其分子量成正比，因此凝胶色谱法可以研究聚合物的分子量分布。胶束色谱：当表面活性剂在水中超过一定浓度(临界浓度)时，多余的表面活性剂不再溶解并聚集成胶束(胶体颗粒)。以胶束分散体系为流动相的色谱称为胶束色谱。它的流动相是胶束多相分散体系，不是真正的溶液；流动相不含有机溶剂。由于胶束色谱的流动相是一个多相分散体系，并且另一相被加入到整个色谱系统中，所以它也被称为伪相色谱。手性色谱是分离手性药物对映体的有效技术。它可分为直接法和间接法：直接手性固定相法；手性流动相添加剂；CMPA)间接法-手性试剂衍生法手性衍生试剂(CDR)，第2节高效液相色谱，输液泵多功能柱塞往复泵，柱塞向前移动，液体输出，流向色谱柱；向后移动，将储液瓶中的液体吸入钢瓶。这种往复运动将流动相连续输送至色谱图例如：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物、四氯化碳和异丙醇或四氢呋喃的混合物、含有强络合剂的溶液等。过滤器通过过滤膜或垂直熔融漏斗过滤，脱气器通过超声波或过滤过滤。请注意，在使用流动相之前，请冲洗，在使用含有酸、碱和缓冲溶液的流动相之后，请用非盐有机溶剂-水冲洗！注：使用后应清洗喷油阀。注射阀废液出口端的高度必须与注射针的高度相同，以避免虹吸现象，导致样本流回注射器或流出废液出口。使用前后，用流动相(不包括酸碱等缓冲溶液)或甲醇或水清洗针孔，并使用针孔清洗机。为了获得良好的精度，注射体积应大于定量环的2-5倍。由于层流的影响，需要过量的样品液体来代替管壁上的流动相(见下图)。在20l定量环中，进样量不应超过10l。否则，一些样品会从出口处丢失。这是因为，由于层流，样品以两倍于平均速度的速度流过管中心。注射前用流动相冲洗注射孔，以移除前一针留下的样品。注射针必须清洗。部分体积进样当样品体积小时，采用部分体积进样。注射量由微型注射器手动控制。要求不超过定量环体积的1/2。检测器紫外检测器可变波长检测器光电二极管阵列检测器荧光检测器电化学检测器蒸发光散射微分检测器质谱、色谱图、min、H、A-曲线(定性)、A-t曲线(定量)，蒸发光散射检测器是一种通用检测器，适用于无紫外吸收的化合物。原理：首先将组分引入充满气体(N2，空气)的蒸发室，加热蒸发流动相并将其除去。样品成分形成气溶胶，产生光散射。测量散射光的强度以获得组分的浓度信号。在这种方法中，流动相在检测前已经蒸发，因此梯度洗脱基线是稳定的。气溶胶、喷雾、蒸发和成分检测，注意：mobile pHase必须是挥发性的，不能含有缓冲盐。氨水和乙酸可用于调节ph值。质谱检测器，色谱柱由柱管和固定相组成，柱管由不锈钢制成，柱长为10 30 cm，内径为2 6 mm，最常用内径为4.6mm。根据键合基团的极性，化学键合相可分为非极性、中等极性和极性。常用的色谱柱有ODS柱、氰基柱、氨基柱等。非极性键合相的表面基团是非极性烃基，如C18、C8等。主要用于反相色谱。C18是最常用的非极性键合相，它是由十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅烷醇基通过多步反应形成的。R1，R2=H，C1，CH3，1 (2，3): 1，根据R1和R2集团，碳含量可分为高碳、中碳和低碳粘结相：高碳R1=R2=CH3，样品负载量大，吸附性能高；中碳R1=h，880si-o-si (h)-c18h37r2=cl si-o低碳R1=R2=cl，中等极性键合相通常具有醚基键合相，根据流动相的极性，可用作正相或反相色谱的固定相，很少使用。极性键合相可用于使用氨基键合相的正相或反相色谱：硅胶-氨基丙基硅烷-si-(CH2) 3nh2氰基键合相：硅胶-氰基甲硅烷基-si-(CH2) 2cn，键合相的色谱ph值控制在2-8，ZORBAXSB-C18键合相使用独特的键合模式，使用特殊的二异丁基硅烷保护硅氧烷键，从而防止键合相在极端ph和高温条件下水解。这些大的侧链防止了键合相的损失，提高了重现性并延长了色谱柱寿命。新的固定相，注意：pH0.8-8.0，最高操作温度90，缓冲液浓度0.01-0.02，避免磷酸盐和car避免在中高酸碱度下使用磷酸盐和碳酸盐缓冲溶液，最高操作温度为60，最佳温度不超过40。分离碱性物质时，所用流动相的酸碱度应比被测物质的pKa值高一个单位。123456789101112，ZORBAXRP-高效液相色谱条件ZORBAXRP-高效液相色谱系列色谱柱，在用缓冲液使用和储存所有色谱柱后，色谱柱必须用水冲洗20-30倍的柱体积。柱体积冲洗体积为1504.6毫米2.5毫升50毫升2004.6毫米3.3毫升65毫升2504.6毫米4.2毫升80毫升。储存色谱柱时，必须使用100%甲醇或乙腈，色谱柱两端必须用接头密封。停止使用几天后最常用时，应使用低流量甲醇清洗约1小时，然后用流动相替换。否则，如果直接使用流动相，柱效率会降低，峰形会变差。使用前，用甲醇或乙腈(0.5毫升/分钟)冲洗新色谱柱。色谱柱失效的症状：色谱柱的峰值压力变宽，拖尾，分裂峰塔板数减少，选择性降低，分辨率保留值降低或增加。色谱柱故障的原因是入口过滤器堵塞并吸收样品杂质。这一栏填得不好。对于长期使用，机械和热冲击会导致中空固定相的化学腐蚀。原因是压力拖尾塔板数的选择性保留值堵塞# # # # # # # # # # # # #分裂峰塔板数# # # # # # # #吸附样品# # # # # # # # # # # # # # # # #和柱下压出现分裂峰现象。填料不与色谱顶部齐平压力冲击应避免突然的压力波动和任何机械和热冲击，如色谱柱掉落在实验台上或色谱柱温度突然变化。在进样过程中，过快旋转进样阀会导致压力波动，从而导致色谱峰出现裂纹。塔压增加的原因很明显。样本成分被保留。强吸附组分容易在色谱柱入口处的填料上积累，严重缩短了色谱柱的使用寿命。特别是生物样品提取物、含油成分等。当出现严重的拖尾峰时，它们通常是强残留污染物聚集在柱口的信号。溶液使用保护柱可以延长分析柱的寿命。每天实验后，用强溶剂(如甲醇-水等)清洗色谱柱。至少是柱体积的20-30倍)。并定期维护，用低流速的强溶剂长时间清洗色谱柱。样品纯度相差，细小颗粒堵塞了管道。样品可以在注射前用滤膜过滤。高样品浓度连续进样，导致过载。如果样品的吸光度不太低，将样品浓度控制在1毫克/毫升以下是合适的。流动相中缓冲溶液浓度过高，有机相比例过大。堵塞色谱过程中的管道。沉淀的盐晶体也会磨损泵和注射阀的密封圈，导致液体泄漏。缓冲溶液的浓度一般控制在20摩尔以下，这是合适的。测定完成后，必须及时用水冲洗。注意！一旦色谱柱压力上升，应停止测量，用水冲洗几个小时或更长时间，并在压力下降后再次测量。如果不清楚哪一段堵塞，应逐级检查，更换泵头上的滤芯，并保护立柱。流动相组成的频繁变化加速了柱效率的降低。最好使用成分和酸碱度相似的流动相，如总是在酸性或碱性条件下工作。色谱柱选择不当或色谱柱(制造商、型号)已被更换很长时间。如果喷射阀旋转不当，应一次旋转到位。它不应该太慢或停止，否则很容易导致峰值开裂。样品溶剂和流动相组分不匹配，样品溶剂和流动相组分不匹配，导致峰前导或峰反转。如果样本使用纯m、色谱软件积分法是一致的，特别是对于色谱峰比较复杂的情况，积分基线稍有变化就会引起峰面积的变化，如果两个峰没有基线分离，峰切割法对峰面积有很大影响，有时使用峰高比峰面积误差小。样品溶液的稳定性一些样品在流动相条件下不稳定，储存后会产生杂质峰。应该引起注意。例如，样品在流动相溶液中不稳定，并且在制备后的不同时间注射。发现在主峰之后将产生杂质峰，该杂质峰随时间快速增加。流动相中的缓冲溶液变成水后，样品测定溶液放置15小时后仍然稳定。高效液相色谱法在药物分析中的应用与鉴别采用标准参照法对中国药典规定的5种测定方法的含量进行检查。中国药典规定了两种定量方法。在进行高效液相色谱测定时，中国药典规定应进行系统适用性试验。系统适用性试验的色谱柱效率为n=5.54(tR/Wh/2)2分辨率R=拖尾因子T=重复性。参考物质或样品溶液应连续注射5次。测得峰面积的相对标准偏差RSD应小于2.0%，2 (tr2-tr1)，w1w2，w 0.05h，2d1，(r 1.5)，(t=0.95 1.05)，其中分辨率和重复性是比较实用的参数(ChP.2005)。定量分析方法的内标要求：样品中不含的成分。保留时间与测试物质相似，但分辨率R1.5。(具有相似的物理和化学性质)具有足够的纯度。外部标准方法-标准控制方法C样品=A样品/A标准C标准、53、常规维护和常见色谱故障、溶剂和样品制备-过滤溶剂的目的是防止固体颗粒损坏仪器或柱头；溶剂瓶中生长的未过滤溶剂或微生物会降低溶剂入口处过滤器头的使用寿命，并影响泵的性能。通常，要求每两天过滤一次。注意：应该使用不同的过滤膜来过滤水相或有机相-聚四氟乙烯可以过滤几乎所有的溶剂、酸和碱-尼龙66可以与大多数有机物质和水相容，但不建议使用强酸、二氯甲烷和DMF-纤维素过滤膜来过滤水相，54。溶剂脱气方法-氦气脱气-真空脱气-回流加热脱气-超体脱气(最常用)-要避免的溶剂-卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液-高浓度无机酸如硝酸和硫酸-自由基形成剂及其混合物-四氯化碳和异丙醇的混合溶液或THF-含有强络合剂的溶液，55。列平衡。为了确保分析结果的重现性，反相色谱柱应使用5-10倍柱体积的流动相平衡色谱柱。注意：新安装的列需要初始化。首先断开色谱柱和检测器之间的管道，然后用流动相将色谱柱中原来的流动相或气泡移出色谱柱，然后连接色谱柱和检测器之间的管道。56岁。保护色谱柱，过滤所有溶剂和样品。使用保护柱仪器后，冲洗整个系统。当系统中的缓冲柱被移除且未使用时，两端应密封。注意色谱柱的酸碱度范围。不要在高压下冲洗色谱柱。请勿在高温下长时间使用硅胶粘结相。57.常见色谱故障-基线噪声。可能的原因-脏检测池-检测灯能量下降-泵引起的脉冲-温度对检测器的影响-检测池中的气泡通过，58，常见色谱故障-基线漂移，可能的原因-梯度洗脱-脏流动相-不平衡柱-系统中的污染物溢出-RID检测器温度不稳定，59，常见色谱故障-鬼峰，鬼峰-色谱峰在没有注射的情况下出现-脏流动相，尤其是水相，常见色谱