霉菌试验简明教程-实验部分

霉菌试验训练课程空军装备环境和可靠性试验中心霉菌试验训练教程空军装备环境和可靠性试验中心实验部分实验一霉菌试验室常用的器具微生物学实验室使用的玻璃盘子多用于消毒、灭菌、微生物培养，因此对其质量、清洗和包装方法有一定的要求。 一般来说，玻璃器具的质量要求硬质玻璃，如果耐高温和暂时烧坏的器具的游离碱的含量不少，则影响培养基酸碱度的玻璃容器的形状和包装方法的要求，以防止杂菌污染为基准的洗涤方法不适当也会影响实验结果。一、器的种类、要求和应用1 .试管微生物学实验使用的玻璃试管，因为管壁要比化学实验室用的厚，棉花堵塞时管口不会破损。 试管的形状被要求不要开口。 否则，微生物从棉花和喷嘴进入试管容易被污染。 棉塞可以使用棉塞、试管帽、橡胶塞等。试管的大小经常选择试管(约1315100150mm )。2 .吸管(也称为移液管)在霉菌试验室中，通常准备1、5、10ml刻度的滴管，与在化学实验室中使用不同，刻度所表示的容量，多数情况下，必须注意将管的前端的液体的体积，即吸引的液体吹走来使用，因此，“吹出”吸管3 .培养皿常用的培养皿，皿底直径90mm，高15mm。 培养皿一般是玻璃制的盘子盖。 在培养皿中放入适量的培养基制成平板，用于菌种的分离、精制、鉴定、微生物的计数等。4 .三角烧瓶和烧杯三角烧瓶有100、250、500、1000ml等不同大小，常用于无菌水、培养基、瓶发酵等。 通常的烧杯有50、100、250、500、1000ml等，用于培养基和药品的调制。5 .载玻片和玻璃罩普通的载玻片大小为7525mm，用于微生物的涂膜、染色、形态观察等。 玻璃罩是1818mm毫米。6 .双层瓶由内外两个玻璃瓶构成，在内层的小圆锥瓶中放入香沥青，用供油镜头观察微生物时使用，在外层的瓶子中放入二甲苯，擦拭油镜头。7 .点滴瓶用于加入各种染料和生理盐水等。8 .接种工具接种工具有接种环、接种针、接种钩、接种刀片、玻璃涂层器等。 接种环、针、钩、铁锹的金属可以使用铂和镍，原则上硬软适度，耐火焰反复燃烧，容易冷却。9 .容量瓶常见的容量瓶有100、250、500、1000ml等不同大小，经常用于决定溶液的体积。二、玻璃器具的清洗方法清洁玻璃器具是实验室取得正确结果的前提条件，因此玻璃器具的清洗是实验前的重要准备。 清洗方法根据实验的目的、器皿的种类、收纳的物品、洗涤剂的种类和污垢的程度等而不同。1 .新的玻璃器具的清洗方法新买的玻璃器具游离碱多，必须在酸溶液中浸泡几个小时。 酸溶液一般使用2%的盐酸或清洗液。 浸泡后用自来水清洗干净。2 .使用过的玻璃器具的清洗方法(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等，请用瓶刷或海绵沾上肥皂、洗涤剂、去污粉等洗涤剂，用自来水清洗。 清洗玻璃器皿后，内壁的水均匀地分布在薄层上，显示油泥完全污染，如果沾上水珠的话，需要把清洗液浸几个小时后，用自来水充分清洗。装有固体培养基的器皿，先把它削掉再洗净。 发霉的培养物先进行高压蒸汽灭菌，然后放倒培养物，再进行清洗。(2)使用吸管吸了菌体或孢子悬浊液的吸管后，必须立即放入装有2%苯酚肥皂溶液或0.25%新钕消毒液或巴士消毒液的量筒或标本瓶内，在24小时内清洗。 为了使吸收其他溶液的吸管不易干燥清洗，请立即放入装有自来水的量筒或标本瓶中。 吸管内壁有油污时，请同样在清洗液中浸泡数小时后再进行清洗。(3)在载玻片和盖玻片中使用的载玻片和盖玻片上滴有沥青时，先用皱纹纸擦拭，或者在二甲苯中浸几次，溶解水垢，用肥皂水煮沸510分钟，用软布或脱脂棉搅拌在稀薄的洗涤液中浸泡0.52小时，用自来水冲洗液，最后用蒸馏水洗几次，晾干后浸泡在95%酒精中保存。 使用时在火焰上烧酒精。 用这种方法清洗保存的载玻片和玻璃罩很漂亮，没有水珠。检查生活菌的载玻片和盖玻片，先用2%煤酚皂溶液或0.25%新清洁消毒液浸泡24小时，再用上述方法清洗保存。3 .清洗液的调制和使用(1)清洗液的调制洗涤液分为浓溶液和稀溶液两种，配方如下浓溶液：重铬酸钠或重铬酸钾(工业用) 50g自来水150毫升浓硫酸(工业用) 800ml稀溶液：重铬酸钠或重铬酸钾(工业用) 50g自来水850毫升浓硫酸(工业用) 100ml配合方法全部是将重铬酸钠和重铬酸钾溶解于自来水中，慢慢加热，溶解，冷却后，一边慢慢加入浓硫酸一边搅拌。 调制好的洗涤液为茶色或橙色，长期使用后，墨水变成绿色会发生故障。 储藏在有盖容器中。 请安全使用。三、玻璃器具的包装略。实验2消毒和灭菌灭菌和消毒有差异。 灭菌是杀死所有微生物的营养体、芽孢和孢子。 消毒是指消灭病原菌和有害微生物的营养体。 灭菌和消毒的方法很多，一般分为加热、过滤、照射和化学药品的使用等方法。由于真菌试验过程中很多步骤要求无菌操作，灭菌是试验整体的重要一环。 灭菌的彻底直接影响着试验结果的正确性，能否正确反映真菌试验的真相也关系到试验结果的可靠性。 一般的灭菌方法有加热法灭菌、紫外线灭菌、化学药品灭菌。一、加热灭菌1 .干热灭菌有火焰燃烧灭菌和热风灭菌两种。 火焰燃烧灭菌适用于接种环、接种针和金属器具，例如镊子等，无菌操作时的试验管口和瓶口也对火焰进行短时间燃烧灭菌。 通常的干热灭菌是指在烤箱内进行灭菌，该方法适用于玻璃器具，例如吸管和培养皿等灭菌，在热风160170下保温2小时进行灭菌。2 .高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌是将灭菌后的东西放入密封的加压灭菌锅，通过加热，使灭菌锅的套管之间的水沸腾，产生蒸汽。 如果水蒸气急剧地将锅内的冷气从排气阀排出，关闭排气阀继续加热，则由于蒸汽不溢出，因此灭菌器内的压力增加，沸点变高，能够得到100以上的温度。 引起菌体蛋白质的凝固变性，达到灭菌目的。 高压湿热蒸汽灭菌具有很大的渗透力，蛋白质容易凝固和变性，是一种可靠的灭菌方法。 可以杀死微生物。 其特点是杀菌可靠、经济、快速、无臭、无味、无毒、安全有效。灭菌时，首先取出灭菌桶，在外侧的锅中放入适量的清水(水没有抵抗)，放回灭菌桶，用纸(牛皮纸、旧报纸)包装被灭菌器和霉菌污染的东西，放入高压灭菌锅中，注意不要妨碍蒸汽流通。 三角烧瓶和试验管口不要接触桶壁，冷凝水要湿掉包口的纸，以免侵入棉塞。盖上盖子，对称地同时拧紧相对的两根螺栓，拧紧螺栓以避免漏气。打开电源加热，同时打开排气阀，使水沸腾，排除锅内的冷气。 关闭排气阀，直到冷气完全排出(直到蒸汽从阀猛烈碰撞为止)，然后压力上升，控制电源电压，直到指针达到0.105Mpa，锅内温度达到121.3，保持压力2030min。在灭菌时间即将结束之前，停止加热，对灭菌锅进行减压，压力锅的针回到接近零的位置后，打开排气阀，排出锅内的蒸汽后，将盖打开1/3左右，用废热晾干试管栓，取出灭菌后的东西，压力不下降的话，打开盖压力容器内的培养基因内外压力不平衡而从试验管口出来，避免棉塞被培养基污染。将取出的灭菌培养基放入29的1恒温培养箱中培养24小时，检查杂菌没有生长待机。蒸汽压力和蒸汽温度换算的关系如表1所示。表1蒸汽压力和蒸汽温度换算的关系蒸汽压力大气压压力计读数蒸汽温度kg/cm2(kg/cm2)磅/英寸2(1b/in2 )1.000.000.00100.01.250.253.75107.01.500.507.50112.01.750.7511.25115.02.001.0015.00121.02.501.5022.50128.03.002.0030.00134.5二、紫外线灭菌紫外线灭菌通过紫外线灯的照射进行，波长为200300nm的紫外线具有杀菌力，其中260nm的杀菌力最强。 紫外线灯距照射物最好在1.2米以下。 为了提高灭菌效果，在开紫外线灯之前，在无菌室中散布2%5%的钠溶液，照射时间为0.5小时2小时。紫外线对人体有害，不能直视紫外线灯。三、化学药品的灭菌化学药品消毒灭菌法是使用杀微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。 即用化学药剂灭菌。 试验室的桌子、器具和洗手用的溶液都用化学药品消毒灭菌。 常用的2%赛车手、0.25%钕、1%水银、35%甲醛溶液、75%酒精溶液等。 常用化学杀菌剂的浓度和应用范围如表2所示表2常用化学杀菌剂的浓度和应用范围分类杀菌剂名称常用浓度适用范围酒精类乙醇50-70%皮肤和器械的消毒酸类乳酸0.33-1摩尔/l空气消毒(喷雾或熏蒸)食醋35毫升/m 3把空气熏蒸消毒，可以预防流感病毒碱性石灰水1-3%地面消毒酚类化合物酚酸5%空气消毒(喷雾)雷萨尔2-5%空气消毒，皮肤消毒醛类福尔马林40%溶液2-6ml/m3接种室、接种箱、接种室的熏蒸消毒重金属离子提高水银0.1%植物组织(根瘤等)的表面消毒硝酸银0.1-1%皮肤消毒氧化剂高锰酸钾0.1-3%皮肤、水果和茶杯消毒过氧化氢3%冲洗伤口氯气0.2-1ppm饮用水洗消毒漂白粉1-5%漂洗培养基、饮用及粪便消毒去污剂新洁尔灭水稀释二十倍不能用皮肤、热器消毒染料结晶紫2-4%外用紫药，浅创伤消毒金属螯合剂8-羟基喹啉硫酸盐0.1-0.2%外用、清洗消毒甲醛熏蒸：在10ml福尔马林(40%甲醛)中加入高锰酸钾5g/m3，密封熏蒸6小时以上，在福尔马林12.5ml/m3中加入等量的水，加热蒸发，熏蒸6小时以上。 实验3培养基的制备和灭菌培养基是人工调制的，适合微生物繁殖，积累新陈代谢产物的混合养分。 通常含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水6种成分。 培养基的种类和调制方法根据微生物的种类和试验目的而不同。 (如营养分类：天然培养基(PDA )和合成培养基(Czapek )物理状态分类：固体培养基、半固体培养基、液体培养基； 等等。 (请参见。)霉菌试验常用的培养基有查兹培养基(Czapek )、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA )、滤纸培养基、真菌培养基等。1 .培养基成分的配比(1)查兹(Czapek )培养基的制备：NaNO33.0gK2HPO41.0g美国航空公司0.5gPS 40.5gFeSO40.01g克蔗糖30.0 g克琼脂十五公斤到二十克水1000ml毫升pH值自然在1.05公斤/cm2 (15磅/英寸)、121.3下灭菌20分钟。(2)马铃薯培养基的制备：马铃薯200.0 g克蔗糖(或葡萄糖)20.0 g克琼脂15.020.0 g水1000ml毫升pH值7.2将土豆削皮，切成1cm3的小块，煮沸30分钟后，用4层纱布过滤，加入砂糖和琼脂，加热溶解，补充水分至1000ml。 在1.05公斤/cm2 (15磅/英寸)、121.3下灭菌20分钟。(3)滤纸培养基(NH4)2SO41.0gK2HPO41.0g美国航空0.5gPS 47 PS0.7g琼脂十五公斤到二十克水1000ml毫升pH值自然滤纸条(放置斜面时放入)6厘米1厘米培养基和纸条在1.05 kg/cm2(15磅/英寸)、121.3下分别灭菌20分钟。(4)无机盐培养基(NH4)2NO31.5gK2HPO41.0gPS公司0.25g克PS 47 PS0.5gFeSO40.002琼脂十五公斤到二十公斤水1000ml毫升pH值自然培养基以1.05 kg/cm2(15磅/英寸)在121.3下灭菌20分钟。 培养球毛壳霉菌时，在斜面上加入滤纸条(6cm1cm )，在1.05 kg/cm2(15磅/英寸)、121.3下分别灭菌20分钟，在倾斜前放入试管斜面。2 .器皿天秤(精度为0.001g )，2000ml搪瓷锅，电炉和电炉，石棉网，500ml烧杯，300ml的水壶，1000ml量筒，漏斗，15150mm试管，玻璃棒，1ml，10ml吸管，p3 .制造方法按照不同培养基成分的配比称量各种药品，用量筒将蒸馏水700ml量入搪瓷锅中，加热至沸腾后加入琼脂使其溶解，再依次加入其他各成分，用玻璃棒搅拌溶解后，以1mol/L HCL将pH调整到7.2。 如果趁热分注到试管内或三角瓶内(分注装置如图1所示)，分注的容量不超过其容量的1/5，三角瓶不超过其容量的1/2。 装上棉塞