PCR检测技术及临床应用.ppt

PCR检测技术及临床应用,北京协和医院检验科韩建华,具体内容,PCR技术简介PCR引物的设计原则RT-PCR实时荧光定量PCR技术罗氏公司的COBASAmplicor乙肝定量检测仪,一、PCR技术简介,PCR简介,聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）是1985年由KMullis创立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。该技术在短时间内就可在体外扩增获得大量的目的基因，从而比较容易对目的基因进行分析鉴定，所以已被广泛应用于分子生物学的各个领域。,PCR技术的基本原理,PCR在体外酶促扩增DNA的原理，类似于天然DNA的复制机制，主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，由变性-退火-延伸三个反应步骤完成：1.变性（denature）2.退火（annealing）3.延伸（extension）,PCR原理动画演示,PCR的基本原理,整个PCR过程一般需要进行三十轮的循环。在最初的循环阶段，原来的DNA链起着模板的作用，随着循环次数的递增，新合成的引物延伸链急剧增多而成为主要的模板，而且PCR扩增产物将受到所加引物5末端的限定，其终产物序列是介于两种引物5末端之间的区域。,PCR的基本原理,理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2n-2n的指数方式递增，但由于DNA聚合酶的质量、待增片段的序列及反应系统的条件等多种因素的影响，实际扩增效率比预期的要低。,PCR的基本原理,PCR反应中，当引物-模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化的反应趋于饱和，出现“平台效应”，即PCR反应产物不再增加。这主要取决于起始模板的拷贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等。,标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul,PCR反应成分,1TaqDNA聚合酶:是影响PCR反应的重要因素，不同的PCR反应都有最适聚合酶用量。2引物浓度：一般为0.1-0.5mol/L。3Mg2+：可影响DNA聚合酶的活性，提高双链DNA的解链温度，一般为1.5-2.0mol/L,PCR反应成分,4dNTP：取决于扩增片段的长度、Mg2+浓度、引物浓度等反应条件，一般为50-200mol/L。5模板：在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高。6添加剂：如：二甲基亚砜等,PCR反应特点,1、特异性强：聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性。2、灵敏度高：PCR产物能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。3、简便、快速：一次性地将反应液加好后，一般在24小时即可完成扩增反应。4、对标本的纯度要求低：可直接用临床标本如血液、体腔液等粗制的DNA扩增检测。,PCR扩增产物的分析,PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。,PCR产物分析,凝胶电泳分析,酶切分析,分子杂交,核酸序列分析,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,Southern印迹杂交,斑点杂交,PCR常见问题,1、假阴性，不出现扩增条带模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化干净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。酶失活：有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。,1、假阴性、不出现条带,Mg2浓度：Mg2离子浓度对PCR扩增效率影响很大。反应体积的改变：应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。,2、假阳性,引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。,3、出现非特异性扩增带,PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多及酶的质和量等引起的。,4、出现片状拖带或涂抹带,PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带，其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。,PCR产生污染的原因,样品的交叉污染；PCR试剂的污染：如加样枪、蒸馏水等产物的污染：最主要的是气溶胶DNA产物溶于空气中；重组质粒的污染：阳性对照；标准品等其它：培养物等,污染的监测,阳性对照：要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本作为阳性对照。阴性对照：它包括标本对照试剂对照重复性试验选择不同区域的引物进行PCR扩增,减少污染的方法,实验室分区：1、样品准备区（前处理）2、试剂准备区：必须保持干净无任何尤其是DNA扩增产物的污染3、扩增区：小心处理产物；区域内必须形成负压,环境污染的处理方法,1.稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；2.紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。,PCR的类型,1不对称PCR2多重PCR3着色互补PCR4巢居PCR5半巢居PCR6二温式PCR7锚定PCR8反向PCR,9锅柄PCR10ALU-PCR11增敏PCR12重组PCR13表达PCR14原位PCR15RNA的聚合链反应16差示PCR17竞争PCR,二、PCR引物的设计原则,如何构建一个成功的PCR反应？,1、目的基因序列的获取获取目的基因序列以制备扩增引物,对于临床的检测项目其目的基因序列多为已知的,其可从以下资源获得:GenBankEuropeanmolecularbiologylaboratory(EMBL)http:/www.ebi.ac.uk,2、引物的设计与合成,引物的结合位置此是由试验的目的决定的a若只是检测目的序列的有无,对引物的定位无严格要求b若是检测某个基因的等位基因,那么扩增子(amplicon)中必须包括目的基因序列,引物的设计与合成,引物长度引物的特异性一般通过引物长度和退火温度来控制,引物的一般长度为15-30bp,但其长度不应超过38bp,常用的是18-27bp.引物的长度增加其特异性增强,但会降低反应效率,引物的设计与合成,引物的3末端和5末端核苷酸a引物的3端是PCR延伸的起始端,不能进行任何修饰,应避免二级结构的形成;引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加;且应当避免在引物的3端使用碱基A.b引物的5端仅限定PCR产物长度,他对扩增特异性影响不大,容许被修饰.,引物的设计与合成,引物中GC的含量：一般为40%-60%.过高或过低都不利于反应.扩增子的大小：一般来讲,扩增子的大小应在100-1000bp之间.避免引物自身和引物之间的互补碱基的随机分布避免引物形成二级结构及发夹结构,PCR引物的设计原则,3、引物的浓度4、Taq酶的浓度5、Mg2+的浓度6、dNTP的浓度7、Tm的温度：DNA模板双链充分解链是PCR成功的前提,在一般情况下Tm取93-94。8、设立实验对照,三、RT-PCR,逆转录-聚合酶链反应,逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。,测RNA的纯度,PCR扩增,cDNA电泳,操作步骤,制备cDNA,防止RNA酶污染的措施,1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2、塑料器皿可用0.1%DEPC(二乙基焦磷酰胺)水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%双氧水室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。,防止RNA酶污染的措施,4、配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37处理12hr以上,然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6、设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。,RT-PCR的应用,分析基因的转录产物获取目的基因合成cDNA探针构建RNA高效转录系统,四、荧光定量PCR,实时荧光定量PCR,实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。,所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,实时荧光定量PCR,在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。,荧光定量PCR的原理,Ct值图解,荧光阈值（Threshold）的设定,一般情况下把PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：Threshold=10SDcycle3-15。,Ct值与起始模板的关系,研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,Ct值和初始模板关系的数学模式,初始模板：X;PCR扩增效率：p;扩增达到某个固定的阈值A时：X(1+p)Ct=A对等式两边取对数：lgX+Ctlg(1+p)=lgAlgX=lgAlg(1+p)Ct由此可知样本初始模板浓度的对数与样本扩增的Ct值呈线性相关,荧光探针和荧光染料,TaqMan荧光探针：PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,TaqMan荧光定量技术流程,1,2,3,4,荧光探针和荧光染料,SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性的掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,实时荧光定量PCR无需内标,实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：,实时荧光定量PCR无需内标,Ct值的重现性：PCR循环在达到Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。Ct值与起始模板的线性关系：由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。,实时荧光定量PCR的应用,新药开发研究，人用药物及其他药物超早期感染用药物及疗法的研究与开发药物疗效研究，人用药物及其他药物新的愈后指标的研究新诊断及检验试剂的开发血液检验漏诊率,其它PCR定量技术,内参照法竞争法PCR-ELISA,五、罗氏的COBASAmplicor乙肝检测仪,世界上第一台用于临床诊断的PCR仪！,NAT国际金标准FDA许可，SDA注册全球销售过4200台,简介,COBASAmplicor乙肝检测仪是由Roche公司生产制造的，它采用的是PCR-ELISA的方法，可对人血清和血浆中的HBVDNA病毒进行定性检测。该分析方法允许同时对HBV靶值和HBV定量标准（QS）DNA进行PCR扩增,HBV定量标准（QS）,HBV定量标准是一种非传染性的线性化质粒，其包含了与HBVDNA靶值相同的引物结合位点和可以与HBV扩增子区别的独特的QS扩增子探针结合区域。HBVQS以已知的拷贝数掺入每个个体标本中，通过标本的制备、PCR扩增、杂交及检测步骤与HBV靶值一同被处理。COBASAmplicor检测仪通过计算HBV信号和QS信号的比值来得出HBVDNA的水平。,DNA扩增/RNA逆转录后再扩增,杂交,光密度计测定与探针特异结合的扩增产物,显色,样本制备,CobasAmplicor基本工作原理,操作步骤,1、标本的制备；2、用HBV特异性的互补引物对靶值DNA进行PCR扩增；3、用特异于靶值的寡核苷酸探针对扩增产物进行杂交；4、通过比色仪来检测探针结合的扩增产物。,仪器简化检测工作流程,温育，杂交,冲洗，留下与探针结合的扩增子,CN4,探针,温育，CN4与生物素结合,冲洗，洗去多余的CN4,SB3,温育，SB3在CN4的作用下显色,检测，660nm处测吸光度,变性液,Amplicon稀释液,3号样本扩增稀释液(1:729),样本原液(1:1),QS扩增原液(1:1),25uL,25uL,25l+200uL弃去150uL,25uL,1号样本扩增稀释液(1:9),QS(1:9)稀释液,2号样本扩增稀释液(1:81),25uL,25uL,COBASAMPLICORMONITOR定量原理,200uL,200uL,200uL,25uL,模板扩增过程,No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122