氨基酸分析技术的应用与实践.ppt

氨基酸分析技术的应用与实践，中国农科学院饲料研究所刘庆生于2005年6月28日公布了氨基酸测定方法的基本框架，氨基酸总量的测定(18种氨基酸) 通常酸水解氨基酸氧化酸水解测定含硫氨基酸碱分解测定色氨酸游离氨基酸添加测定生物材料中的游离氨基酸测定、蛋白水解氨基酸总量的测定常规酸水解-色氨酸、含硫氨基酸以外的蛋白水解氨基酸(15种) 的氧化酸分解测定以HBr为终止剂-色氨酸、酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸以外的蛋白水解氨基酸(14种)测定以亚硫酸钠为终止剂-色氨酸、酪氨酸以外的蛋白水解氨基酸(16种)的碱分解原理：蛋白质是氨基酸与-氨基通过-羧基形成酰胺键，共价键形成的多聚物。 因此，测定氨基酸必须先水解，打开氨基酸之间的多肽键，再进行分离、测定。 这种方法可以测定15种氨基酸，但含硫氨基酸(主要是膀胱、半胱氨酸和蛋氨酸)经水解氧化，生成多段氧化物，测定困难，色氨酸都分解成NH3和CO2，无法测定。 基本的过程控制是，将含有7.525mg蛋白质的样品在10.00ml、6mol/lhcl在液体N2中冻结，真空抽至7Pa(510-2mmHg )，封管，放置1101烤箱，水解2224h，冷却、冷却加入适量的样品稀释液，混合、离心或过滤，取上清液，使各氨基酸浓度达到50250nmol/mL，测定、基本程序，过程控制(1)，酸解法(通常的酸分解和氧化分解-酸分解)样品粒度和称量样品的均匀性谷物粒30mg饲料氨基酸测定基准： 40目筛，100mg氨基酸基准的0.3-2倍(预先测定粗蛋白含量)。 粗脂肪含量5%的样品必须脱脂。 流程控制(2)、酸分解剂(浓度、添加酚)酸样品比(可在40倍范围内变化)欧洲： 10mgN:20/500ml北美： 10mg蛋白：2/40ml水解方式：真空(充n )封管/回流水解温度和时间110-22h、135 氧化酸分解原理：样品通过甲酸处理将蛋白质中的胱氨酸和蛋氨酸分别氧化成丙氨酸和蛋氨酸，进行酸分解，打开多肽键形成单一氨基酸混合液，用色谱分离、测定。基本工艺控制，含蛋白质7.525mg的样品，2mL过甲酸，0氧化16h，终止剂，HBr0.3mL，15min静置，在60以下真空浓缩到干燥，6mol/LHCl10mL，110水解，以下操作为同酸分解，33.6% LHCl15mL110偏重回流水解、pH调整、定容至50mL、过滤、卷扬机、基本程序、过程控制、过甲酸使用量10mgN:0.3-33ml； 7.5-25mgN:2-10ml冷氧化(0-16h )与热氧化(55-15min )不同的终止剂HBr:Trp、Tyr、His、Phe偏重亚硫酸钠： Trp、Tyr酸分解方式的蒸干和pH调整是根据需要选择方法的高盐样品(将50100mg样品放入特氟隆管中，在1101下将20h水解，1.5ml的4mol/llioh，液体N2冻结，抽真空，使之成为7Pa (或N2 )，封管，将冷却开放管转移到25mL，将pH调整到约4，水色氨酸的测定、基本步骤、工艺控制碱分解剂NaOH、LiOH、Ba(OH)2KOH水解时间内标不同的测定方法基于比色法的离子交换色谱HPLCUV、Fluro、游离氨基酸的测定饲料， 添加到食品中的游离合成氨基酸的测定氨基酸肥料中的游离氨基酸的测定生物材料中的游离氨基酸的测定动作，植物组织中的游离氨基酸的测定-蛋白生理体液中的游离氨基酸，沉淀蛋白尿中的游离氨基酸的提取和除去，游离氨基酸的测定中的问题，这些样品不需要水解，但是， 从固体样品中去除干涉测定的其他物质(蛋白、金属离子去除蛋白法：化学沉淀法、高速离心法、超滤法和离子交换法去除金属离子的方法：化学沉淀法(EDTA )、蛋白沉淀剂的选择：苦味酸、磺基水杨酸(SAA )、三氯乙酸、乙醇Ohara将上述沉淀剂与丙酮、硫酸锌、氢氧化钡、钨酸钠等9种沉淀剂的测定效果进行了比较，证明了苦味酸、SAA和乙醇效果最好。 随着柱前诱导HPLC法的应用，甲、乙醇沉淀、高速离心和超滤法和这些方法的结合越来越广泛： Davey等人用PITC/HPLC测定生理体液，认为血浆、羊水最适合用乙腈作为沉淀剂，脑脊液最适合用超滤法农业研究中，植物的根、茎、果、浆经常使用80%的乙醇沉淀蛋白质。 游离氨基酸的提取，用0.02mol/L浓度的酸反复提取，过滤或离心，将上清收集到规定体积，用0.1mol/L浓度的酸提取一次，用水反复提取，将上清收集到规定体积，最终盐酸浓度约为0.02mol/L。 实验证明，后者比前者好。 添加的游离合成氨基酸的测定，一般食品饲料中添加的合成氨基酸赖氨酸蛋氨酸色氨酸12g样品0.1mol/LHCl30mL，搅拌萃取15min，可以用水定容、过滤、无脱蛋白直接测定。 蛋白质、脂肪含量高的样品需要脱脂和沉淀蛋白质，含有氨基酸的叶面肥中游离氨基酸的测定，称为样品1-5g，放入250mL的容量瓶中，加水至刻度均一，取2mL上层清洗液，取5%磺酸溶液2mL 再加入1mL溶液和1 ml 0.06 mol/l盐酸溶液，用离心分离机离心15分钟。生物材料和液态食品中游离氨基酸的测定、固体组织生理体液、 固体组织中游离氨基酸的测定动物组织：用2g 5倍体积的3%磺基水杨酸-高速组织破碎机破碎-10000rpm离心15min-上清提取机(1g 5mL柠檬酸缓冲液pH2.2-均聚物-1800078000g离心或0.5g 3ml5%三氯乙酸植物组织：新鲜样品5g 7075%乙醇-沸腾水浴中回流提取20min过滤-残渣的提取-过滤3次，从滤液-沸水浴中蒸馏除去乙醇-醚提取-用水层蒸发 0.02mol/LHCl， 生理体液和液态食品中游离氨基酸的测定血浆：新鲜血浆1mlph1.5柠檬酸缓冲液-冰箱中30min-高速离心(18000g/30min或78000g/20min )脑脊髓液， 眼内液：加入新鲜的样品液等体积8%磺基水杨酸(1mL 6mL5%三氯乙酸或2mL 10倍体积的80%乙醇)，放入加入了10000rpm离心尿： 5mL 4mol/LNaOH-pH11.512-浓硫酸的干燥器中-减少含有酱油、果汁和植物材料的液体食品： 9倍的1%磺酸-700010000rpm离心，影响分离的因素-1，缓冲液的pH (缓冲液交换时间) Cys对缓冲液的pH和交换时间最敏感， 缓冲器aph的高度和buferb缓冲液交换过快的Cys的峰值与Ala (丙氨酸)的粘连和重叠快，相反，如果缓冲器aph低或缓冲器的交换慢，Cys与Val (缬氨酸)粘连和重叠。 日立机器中，Cys对1#、2#缓冲液的pH和3#缓冲液的交换时期最敏感，是影响分离的主要原因-2，没有添加或少添加作为修饰剂的醇buffAla，Asp、Thr、Ser的分离不良，Gly、Ala的分离良好如果buffala的醇添加过多，有利于Asp、Thr、Ser的分离，不利于Gly、ala的分离，泵1的压力也显着上升。 日立机器以乙醇为修饰剂，SYKAM机器以甲醇为修饰剂。 影响分离的因素3、柱温度影响峰值时间和峰值宽度，其中Asp和Glu最敏感，Asp在30峰值为Thr后，在45为Thr前。 温度过低时峰值扩大，影响分离，因此氨基酸分析柱的温度一般为5060。 柱温度有利于Thr、Ser分离，但不利于Tyr、Phe分离。 日立机器的分析是在相同温度下进行的SYKAM机器采用梯度升温。 影响分离的因素4、柱效应使用后发现氨基酸分离的话，特别是前面的Asp-Glu变坏，泵压变高，Ileu-Phe段的噪声变多，氨的台阶变高，可能是树脂被污染了。 污染源：样品中的蛋白、多肽、脂肪或重金属如铬，洗涤液配置过程中的问题(1)， 试剂的所有化学试剂都必须在分析水平上使用塑料容器中储藏的化学试剂，绝对不要在氨盐或氨液附近处理氨的地方准备试剂，只使用小心清洗的玻璃器具， 请不要接触玻璃器具内部(因为皮肤上有很多游离氨基酸)要过滤试剂，只能使用孔径为0.45m的薄膜过滤器，或经常清扫的玻璃过滤器。 冲洗液配置过程的问题(2)，去离子水18.2M/cm去离子水新鲜自来水直接蒸馏也达不到所需品质，冲洗液配置过程的问题(3)，Buffer氨基酸分析的提取液需要两种不同的缓冲液系统。 钠盐缓冲液用于蛋白质水解氨基酸的分析，锂盐缓冲液用于生理体液中的游离态氨基酸的分析。 在柠檬酸钠或柠檬酸锂缓冲液中，钠或锂离子和氨基酸在树脂上作用有两个磺酸基的so3键交换位置。 多馀的柠檬酸根作为“缓冲”，能得到不同的正确的pH值，氨基酸与作为磺酸基的so3解离。 谷氨酸和天冬氨酸的分离只能用锂盐缓冲液分离，而不能用钠盐缓冲液分离。 冲洗液配置中的一些问题(4)，因为缓冲液的调制溶液的pH值受温度影响，标准缓冲液必须在不同的温度下校正。 调整pH值时要尽量避免因不足而过剩。 NaOH和LiOH改变缓冲液的当量浓度调整pH后，等待1015分钟，再检查一次，直到pH稳定。冲洗液的配置过程中的几个问题(5)，茚三酮溶解吲哚结晶的溶剂通常使用乙二醇单甲醚(MCS )或二甲基亚砜(DMSO )，大部分使用乙二醇单甲醚，但以上两种人参醇试剂的吸光值的结果(灵敏度)相同，精氨酸的检测最好使用MCS人参醇试剂，另外DMSO人参醇试剂容易被氧化，难以长期稳定。 冲洗液配置中的几个问题(6)，乙二醇单甲醚过氧化物试验：将5ml的氟化钠溶液加到5ml乙二醇单甲醚中，如果溶液干净，该乙二醇单甲醚溶液含有过氧化物乙二醇单甲醚中过氧化物的除去：是将30gFeSO4x7H2O和3ml的h2so4加入到60ml去离子水中制成的溶液10ml加入到乙二醇单甲醚溶液1L中进行蒸馏，剩下的约10%的溶液蒸馏冲洗液配置过程中的几个问题(7)，乙酸钠/乙酸锂缓冲吲哚醇反应的最佳pH值必须为pH值5.0。 乙酸钠/乙酸锂缓冲液是一种强缓冲液，无论洗脱液的pH值如何，混合后的溶液的pH值总是5.0。 还原剂三氯化钛和二氯化锡容易引起沉淀，导致反应器堵塞。 维生素C的背景高的四硼酸氢钠还原了吲哚醇，冲洗液的配置过程中的几个问题(8)，吲哚醇的调制是用氮气从底部吹35分钟或吸引脱气，用氮气密封该吲哚醇溶液1天(气压约0.5bar ) 人参醇溶液的保存期间取决于主要使用的还原剂的性能。 通常必须在20天内用完。 SYKAM开发出一种环保的新还原剂，使有效的茚三酮溶液稳定3个月以上。 影响其他分离、定量的因素-1，氨基酸标准h型标准溶液： 2.5Mol/ml的氨基酸溶解于0.1NHCI和0.1%的苯酚中(只有胱氨酸Cystine为1.25nMol/ml )。 柠檬酸型标准溶液： 100nMol/ml的氨基酸溶解于pH2.20的柠檬酸钠样品中的稀释溶液。 注意：请在4下保管！ 啊！ 啊！ 故障：谷氨酸检测结果提高，影响其他分离、定量的因素-2，缓冲液流速不稳定，峰值时间和峰值面积变动变大的泵：气泡、漏夜接头：漏夜人参醇溶液的显色能力每天每10样品标准泵的流速， 校正漏夜样品量：样品体积过大(不可超过6%柱床)浓度过大或过小，影响其他分离、定量的因素-3 a、缓冲液和样品的温度变化b、Cu和氨