细胞培养基本知识基本技术

.细胞培养的基本知识，基本技术，医学院中心实验室谷景义，主要内容：1，细胞培养的基本知识2，细胞生长的条件3，细胞培养的基本技术，1，细胞培养，将获得的组织用机械或消化的方法分散到单一的细胞中，用培养基制备细胞悬浊液，在体外适当的条件下使细胞生长，保持一定的结构和功能特性。 培养细胞的特性1-生长方式和类型、密合型、浮游型、培养细胞的特性2-增殖特性、体外培养细胞虽然保持着一定的体内细胞的基本特性，但也有其自身的特征。 粘贴-伸展接触抑制-增殖的密度抑制，粘贴-伸展、接触抑制，如果一个细胞被其他细胞包围，无法去任何地方而继续接触，细胞就不会移动，在接触区域的细胞膜活动停止。 因此，一般正常的细胞不会重叠在其上生长。 当细胞增殖密度受到抑制，细胞生长汇合成为单层时，细胞比较拥挤，其分裂停止，该细胞在静止状态下可以维持一段时间的生存，但分裂生殖无法继续。 转化细胞和恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们的接触抑制和增殖密度抑制常常下降，可以增殖到较高的终末细胞密度。 培养细胞特性3生长过程、单细胞增殖：细胞周期、高等生物、细胞周期时间长短的变化主要集中在G1期，s、G2和m期几乎稳定。 Hela8-16h5-9h2-8h20-28h，细胞增殖：细胞生长曲线，接种后，每天进行测量，以细胞数为纵轴，以时间为横轴绘制。 测定细胞绝对生长数的常用方法也是判定细胞活力的重要指标，也是培养细胞生物学特性的基本参数之一。 饱和密度：在特定条件下，培养器内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度时，细胞群就停止繁殖。 潜伏期/停留期指数成长期的平台期/停滞期的退化或死亡，细胞系的生长过程细胞系：初代培养细胞首次成功传代后，成为细胞系，可指一般可传代的细胞。 细胞株：通过筛选和克隆化，从原代细胞和细胞系中获得具有特殊性质和标记的细胞。 细胞系亚系：从某细胞系分离出来，性质上与原细胞系不同的细胞系，称为该细胞系的亚系，有限细胞系：如果继承代或继承代不延续，则称为有限细胞系。 连续细胞系：可连续传代的细胞称为“连续细胞系或无限细胞系”。 可以培养50多岁，无限培养。 许多二倍体细胞是有限细胞系。 无限细胞系大多数都有变异。初代细胞：从生物体获得组织材料，在体外培养成长，直到第一次继承。 继代细胞：继代细胞持续生长时，达到一定的细胞密度后继代的细胞。 培养瓶培养法、方法：将培养对象直接接种到培养瓶中，放入培养罐中培养。 优点： 1、能避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响。 2 .显微镜观察、染色等操作、永久保存变得容易。 3 .增加了培养瓶的培养面积。 培养板培养法、方法：将培养细胞接种到培养板孔中，在CO2培养箱内培养。 应该培养的量少也称为微量培养。悬滴培养法也被称为植块悬滴培养法，是最初确立的体外培养技术。 基本要点是，将组织和器官的植块接种到玻璃罩上，滴下培养液，将玻璃罩翻过来，把植块和营养液吊在玻璃罩下，放在凹状的载片上，最后用蜡密封后，放入培养罐中进行培养。 1907年-Harrison通过细胞培养解决了难题的玻璃罩包复凹型载玻片悬滴培养法、悬滴培养法的基本步骤，1 .向玻璃罩上滴下胚胎提取液、血浆和植块，进行混合。 培养基凝固后，包埋植块。 2 .在凹载片周围涂凡士林。将凹版片材压在玻璃罩上，3、反转凹版片材，在玻璃罩周围涂蜡。 放入培养箱培养，1910年至1923年，-Carrel和早期组织培养加勒比培养法，1943年Earle、Dulbecco等建立了单层细胞培养法，首次建立了长期继承的l细胞系。 1951年Gey首次建立了人肿瘤细胞Hela细胞系。 从50年代末开始，组织培养技术的应用进入了蓬勃的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各领域。 无血清培养、无血清培养基：是不添加血清就能维持细胞在体外长期生长的合成培养基。 但是，可能含有个别的蛋白质和大量的蛋白质成分。 基本成分是基础培养基和添加成分两大部分。 为了观察某种生长因子对某细胞的作用，需要排除其他生长因子的干扰作用。 血清可能含有各种各样的生长因子，另外，还需要检测某些细胞分泌培养中的物质(抗体、生长因子)的能力，或者大规模培养某些细胞得到分泌物。 目标通常很强，价格也很高。三维细胞培养技术是将具有三维结构不同材料的载体和各种细胞在体外共同培养，使细胞能在载体的三维立体空间结构中移动、生长，构成三维细胞-载体复合体。 普通的细胞培养，由于细胞在体外变化的环境下增殖，就失去了原来的性状，经常与体内的状况不一致，虽然动物实验完全在体内进行，但由于体内各种因素的制约和体内与外界环境的相互影响而变得复杂，难以研究单一的过程，难以研究中间的过程。 三维细胞培养技术是介于单层细胞培养和动物实验之间的技术，能最大限度地模拟体内环境，表现细胞培养的直觉性和条件控制性的优势。 应用：软骨和骨组织(软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨，骨)循环系统和心脏(目的改变血管形成)，目前常用的三维培养模式：基质垄断培养旋转烧瓶培养微支架培养旋转细胞培养系统的自发细胞聚集，细胞培养技术的特点和应用，优点：1) 研究条件可以人为控制；2 )研究样本均匀；3 )研究内容的观察、测定、记录容易；4 )研究费用经济缺点：体外培养的细胞与体内细胞不完全相等。 应用，病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产免疫学：杂交瘤-单克隆抗体遗传学：染色体分析肿瘤学：重要的抗肿瘤药的筛选分化和发育：刺激使细胞群变化细胞毒实验：药效测试临床医学和组织工程软骨损伤修复； 试管婴儿、营养需求、环境要求、无毒和无污染、二、培养细胞的生长条件、1、细胞的营养需求、(1)氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子(2)生长促进因子等完全培养基的组成：基础培养基的80%95%、血清的5%20%、碳酸氢钠的2. 链霉素各100单位/ml，基础培养基的选择，参考： (1)生产某细胞株的培养基必须是培养该细胞的最佳培养基。 可以在查阅参考文献或购买细胞株时咨询。 (2)请尝试其他实验室常用的培养基。 很多培养基适合很多细胞。 (3)用多种培养基培养目标细胞，观察其生长状态，用生长曲线、村落形成率等指标判断，根据实验结果选择最合适的培养基是最客观的方法，但很麻烦。 常用的培养基种类RPMI-1640 (标准型)、DMEM-高糖(标准型)、DMEM-低糖(标准型)、DMEM-F12等、血清、热灭活： 56、加热30分钟完全解冻的血清(现在很少)热灭活目的：使血清中的补体成分灭活。 建议如果不进行细胞因子和免疫的实验，就不要使血清失活。热处理会增加血清沉淀物，影响血清质量。 很大程度上影响细胞的生长速度，细胞的壁率降低。 血清中的沉淀物絮凝物：血清中的脂蛋白改性和解冻后血清中的纤维蛋白，这些絮凝物不影响血清本身的质量。 离心力3000rpm，5分钟就能去除，无需在显微镜下处理“黑点”:热处理后的血清沉淀物的形成显着增加。 有些沉淀物在显微镜下观察得像“黑点”，经常被误解为血清被污染了。 一般来说，这种黑点不影响细胞的生长，如果怀疑血清质量，则必须立即停止使用，更换另一批号的血清。 血清质量的好坏是实验成功与否的关键。 常用血清：胎牛血清、牛犊血清、兔血清、马血清等，胎牛血清质量最好。 优质血清标准：透明，淡黄色，无沉淀物，细菌，支原体，无病毒污染。pH调节液、NaHCO3溶液(碱)的常用浓度为7.5%。 调制时用三蒸水溶解后，过滤除菌、高压灭菌、分注、在4保存了HEPES (分子量238.31 )溶液的弱酸、羟乙基哌啶硫酸、对细胞无毒性的主要作用：防止培养基pH的急剧变化。 在开放培养条件下观察细胞，培养基脱离5%CO2的环境，CO2气体迅速脱离，pH急速上升，加入HEPES后，pH维持在7.0左右。 一般在进行克隆培养时添加HEPES，最终浓度一般为10-50mmol/L，经常配合到1M贮液中：用20ml的双蒸洒水溶解HEPES，进行过滤除菌和高压灭菌，小瓶分注，在4下保存。 使用时，在100ml培养液中加入hepes浓缩液2ml，最终浓度为20mmol/L，使用抗生素：培养液调制后，在培养液中加入适量抗生素，抑制可能存在的细菌生长。 通常同时使用青霉素和链霉素。 最终使用浓度为每毫升100单位。RPMI1640培养基1000ml、RPMI1640干粉培养基10.4g(1包)超纯水400ml磁力搅拌，将完全溶解超纯水定容到1000ml，在超纯水桌子内的无菌条件下，用在灭菌后的过滤器中加入了0.22m的开口过滤器的过滤器除菌，2000 以前用一个瓶子溶解，每200ml的培养液失活的小牛血清的最终浓度为10%，加入了22ml。 加入青霉素和链霉素的最终浓度分别为100U/ml。用于分离消化液、组织和分散细胞：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA )单独或混合使用，胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶与赖氨酸或精氨酸相连，作用于多肽健，去除细胞间粘蛋白和糖蛋白，去除细胞骨架胰蛋白酶液的浓度越高，作用越强，但超过一定程度的话，细胞就会损伤。 胰蛋白酶液的消化时间：2-10分钟。 用含有血清的培养液停止细胞的消化作用，将胰蛋白酶粉末放入烧杯中，将D-Hanks平衡盐溶液制成少许糊状，补充D-Hanks平衡盐溶液(常用浓度为0.25% )搅拌，在室温4小时或冰箱中过夜，继续搅拌，第二天，用滤纸粗过滤，过滤在-20下保存(避免分解不良)的胰蛋白酶溶液的偏酸，使用前可以用碳酸氢钠溶液将pH调节到7.2左右，可以用胰蛋白酶溶液调制，EDTA4Na溶液是化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，毒性小，廉价注意：用EDTA处理细胞后，必须用平衡盐水清洗。 由于残留的EDTA影响细胞的生长，因此d-hanks平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions，D-HBSS )、2、环境要求、细胞培养在细胞生存和繁殖的生理学接受限度内的物理化学特性(1)温度(2)气相(3)PH，、 在达到最佳温度(37 )前，一般的细胞繁殖率随着温度的上升而增加，但温度逐渐上升超过最佳温度时，繁殖被抑制。温度为25-35时，细胞的生长速度虽然很慢，但如果能生存的细胞即使4天也能生存几天的温度在0以上的话，细胞还可以加入能生存的保护剂保存在液氮中。 高温的话，用41-42培养1h，细胞损伤严重，达到43以上的话，很多细胞死亡。 高温对细胞的影响比低温更显着。气相和PH值、5%CO2 95%空气混合气体(O2)。 CO2是细胞生长所必需的同时，细胞代谢的产物，与维持培养基的PH有关。 最佳PH7.2-7.4低于PH6.8或高于PH7.6时，可能会对细胞有害而死亡。酚红指示剂：黄-6.6-橙-8.0-红、3、无毒无污染、无毒：无毒是细胞培养的必要条件。 所有与细胞直接或间接接触的东西都必须无毒。 如果有细胞毒性，细胞就容易死亡。 因此，在选择器皿和材料时需要注意。体外培养的细胞没有机体免疫系统，没有防御能力，一旦发生细菌等污染，细胞最终死亡。 交叉污染容易失去细胞系的本来特性。三、细胞培养的基本技术，1、原代细胞培养2、传代细胞培养3、培养细胞的生长状况的观察4、细胞冷冻保存、复苏、运输、无菌操作中的注意事项，在无菌操作中，必须在维持工作场所的无菌清洁操作前，用紫外线灯对无菌室和无菌操作台进行30分钟灭菌， 用75%或70%的乙烯擦拭无菌操作台，打开无菌操作台风扇操作10分钟时，慎重地取下无菌的实验品，避免引起污染。 请勿触摸吸管的前端或瓶口，或在打开的容器正上方进行实验。 打开容器后，用手夹着盖子握住躯干，倾斜约45角，注意作业中，有细菌意识，正在进行无菌作业！ 1、原代细胞培养、原理：从机体中提取动物机体的各种组织，用各种酶(常用胶原酶)或组织壁法处理，得到单一细胞或细胞群，在适当的培养基中培养，使细胞生存、生长、繁殖。 仪器、材料及试剂： CO2培养箱、培养瓶、平盘、烧杯、吸管、移液管、手术器具、计数板、离心分离机、水浴箱(37)1640/DMEMF12培养基(含10%血清)、2%胶原酶、PBS、酒精、组织消化法开始工作前洗手，用75%的酒精把手擦在肘部。 2 .处理组织：采集的标本必须在4H内完成。 取出6-10cm的脐带，放入烧杯和平盘中，用PBS液漂洗23次，除去血污的组织有可能被污染的情况下，先放入含有青霉素的混合液中3060分钟。 3 .切割：用手术将组织块切成23立方毫米大小，用眼科将组织切成1立方毫米小块，易于消化。 加入组织块总量和1:1的2%胶原酶，放进瓶子里封口。 4 .消化：恒温水浴，37的烤箱都可以消化。 消化过程中请每20分钟摇动一次。 最好用电磁恒温搅拌机消化。 消化时间取决于组织块的大小和组织的硬度。 37气摇床100转/min、1.5-2h、5 .分离：组织分散到细胞块或单细胞后，立即停止消化，加入至少5倍体积的PBS稀释消化液，然后通过200目不锈钢筛子，消化不充分的组织块2500rmp离心消化20分钟，吸收上清，加入8-10mlPBS、1000rmp离心5min，吸收上清，加入含有适量血清的培养液。 6 .计数：用计数板计数，如细胞悬浊液的细胞