第十一章 质谱技术在蛋白质多肽化学.ppt

第11章质谱在蛋白质和多肽化学中的应用，第1节蛋白质和多肽质谱的发展，第2节质谱在蛋白质和多肽分析中的应用，第1节蛋白质和多肽质谱的发展，第1部分基本原理，质谱是一种分析方法，它根据化合物的质荷比(M/Z值)将化合物分离并确定为离子和碎片离子，以分析它们的组成和结构。蛋白质和多肽质谱是通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场和磁场分离出具有特定质荷比(m/z值)的蛋白质离子，通过离子检测器收集分离出的离子，测定离子的m/z值，分析和鉴定未知蛋白质。蛋白质和肽质谱的发展历史。20世纪60年代，科学家已经注意到质谱在蛋白质和肽的结构分析中的潜力。然而，由于电离技术的限制，在过去的30年中，质谱仅用于有机化合物小分子的结构测定。然而，它对于大分子(分子量超过1000道尔顿)、极性分子和难以蒸发的分子是无能为力的。20世纪70年代，麦克法兰等人发明了一种被称为等离子体解吸(PD)的电离技术，这种技术将质谱的分子量范围扩大到几千道尔顿。Barber等人在20世纪80年代早期引入了快速原子轰击(FAB)电离技术，并成功地确定了26肽的结构，从而使质谱应用于蛋白质和肽的结构确定的假设成为现实。在20世纪80年代后期，两种更新的技术被开发出来，即由JohnFenn发明的电喷雾电离(ESI)和由Hillenkamp等人发明的基质辅助激光解吸电离(MALDI)。这两种技术解决了大极性和不稳定热的蛋白质和多肽的大分子量的电离和测定问题。此外，两种质谱分析混合物的灵敏度、准确度和复杂性较之前的技术有了显著提高，从而大大拓宽了质谱在蛋白质领域的应用，可以说是质谱在生物大分子中应用的一次革命。第二部分介绍了蛋白质和多肽质谱技术、蛋白质和多肽质谱技术，质谱计由离子源质谱分析仪、检测器串联质谱和耦合技术组成，质谱计由四部分组成：样品引入系统根据电离模式的要求将样品发送到离子源的适当部位；离子源用于电离样品分子以产生离子，并将产生的离子会聚成具有一定能量和几何形状的离子束。质量分析器通过使用电磁场(包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场、高频脉冲电场等)的作用从离子源分离离子束中具有不同质荷比的离子。)以空间位置、时间顺序或运动轨道是否稳定的形式；检测器用于接收、检测和记录分离的离子信号。质谱仪、计算机数据处理系统、真空系统、加速区、样品引入系统、离子源、质量分析器、检测器、电离分离、检测器、输出、离子源的组成，离子源的功能是将样品引入系统引入的气态样品分子转化为离子。由于电离所需的能量因分子而异，不同的分子应选择不同的离解方法。一般来说，给样品提供较大能量的电离方法是硬电离法，而给样品提供较小能量的电离方法是软电离法。后一种方法适用于容易破碎或电离的样品。离子源是质谱仪的核心，可视为相对先进的反应器，样品在其中经历一系列在极短时间内(约1 s)发生的特征降解反应，因此可快速获得质谱。电离法、电子轰击电离法、电子电离化学电离法、电离场电离法、场解吸场电离法、场解吸场电离法、快速原子轰击快速原子轰击法、FAB电喷雾电离法、ESI基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离法、MALDI大气压化学电离大气压化学电离大气压化学电离法、APCI电离法。其中最广泛使用的是质谱联用仪和电喷雾质谱联用仪。这两项新技术显著提高了质谱分析的范围和灵敏度，从而开发了新的软件和检测器。直到20世纪80年代fab质谱被发表，FAB质谱才真正扩展到蛋白质领域。它是一种待测化合物，通过快速原子轰击分散在高沸点溶剂(如甘油)中，从而产生分子离子。快原子是由电离惰性气体氩、氙或氦产生的。由电离惰性气体氩、氙或氦产生的氩、氙或氦被电场加速，因此具有相对大的动能。之后，电荷交换反应通过氩气室进行：氩(高动能)氩(热运动)氩(高动能)氩(热运动)，电荷交换后的低动能氩(热运动)被偏转出快速原子流。具有高动能的快速氩原子轰击样品分子。通常，样品放在甘油基质中。当快原子束轰击涂覆有样品的金属板时，快原子的大量动能以各种方式耗散，并且一些能量导致样品的挥发和离解。FAB-MS、FAB-MS特性，这种方法要求简单、灵敏。FAB产生的分子离子非常稳定，不易破裂。这是准确测定多肽化合物分子量的有效方法。当应用于一些更复杂的混合物时，可以测量每个组分的分子量。当然，由于难以获得片段峰，FAB质谱在确定多肽序列时遇到了困难。电喷雾电离利用强静电场直接从溶液中产生气态电离分子。电喷雾电离可以与各种注射器结合使用，如液相色谱、高效液相色谱、毛细管IEF和毛细管电泳。污水在强电场作用下形成带电喷雾，并在电场力的作用下通过气幕。电喷雾质谱，电喷雾质谱，电喷雾质谱一般分为正电喷雾质谱和负电喷雾质谱。正离子电喷雾电离原理：将2.56kV的高电压施加到金属喷嘴的尖端。在强电场的作用下，样品溶液从针尖的小孔中喷出，变成带正电的液滴。在从头部流出的热氯气的作用下，液滴表面的溶剂蒸发，液滴变小，液滴的电荷密度突然增加。当静电排斥力等于液滴的表面张力时，液滴分解形成更小的液滴。这样形成的小液滴继续以类似的方式分解，使得液滴中的溶剂快速蒸发，产生多电荷正离子，这些离子被分析并记录在质谱仪中。负离子交流阻抗谱的过程类似于此，但电却相反。电喷雾电离质谱，瑞利限达，-，带电液滴，样品离子，受激准分子离子，其它离子，电喷雾电离质谱，这种分子离子的特征是分子离子往往携带多种电荷。这些离子是由几个质子的吸附或损失形成的，因此在正离子或负离子光谱中可以观察到(M-nH)n或(M-nH)n-的峰。对于生物大分子，电喷雾质谱通常显示一组带有不同电荷的分子离子峰，分子量值可根据仪器上记录的每个峰的质荷比和电荷数来计算。事实上，从一组峰中可以计算出无数的分子量值，而且它们之间略有不同。通常，特定的程序需要在计算机上处理，以找出最接近实际值的分子量值。电喷雾质谱的特点和优点：它解决了大极性和热不稳定性蛋白质和多肽分子的电离，以及大分子质量、一级结构和共价修饰位点的测定，可用于蛋白质和多肽分子的质谱分析基质辅助激光解析电离(MALDI)技术产生的离子通常被飞行时间探测器检测到，因此MALDI的名称通常与飞行时间相关联，即MALDI-TOF-MS。简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱仪将多肽成分转换成离子信号，并根据质量/电荷比(m/z)分析多肽，以确定多肽来源于哪种蛋白质。在MALDI-MS中，将待测样品与含有特定波长的光吸收基团的化学基质混合，然后将样品混合物滴在平板或载玻片上进行挥发，样品混合物中残留的水和溶剂的挥发导致样品结合成晶格晶体，然后将样品置于激光离子发生器中。激光作用于样品混合物，导致化学基质吸收光子并被激活。这种激活产生的能量作用于多肽，使其从固体样品混合物变为气态。多肽离子只有一个电荷，因为多肽分子倾向于吸收单个光子。这些形成的多肽离子直接进入质谱仪。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子从分析仪一端飞到另一端检测器所需的时间。然而，该飞行时间与多肽离子的质量/电荷比成反比，即质量/电荷比越高，飞行时间越短，飞行时间飞行时间质量分析仪被认为是与MALDI的最佳匹配。对于某些分子量较大( 1000000道尔顿)或疏水性较强的蛋白质，MALDI比ESI更有效。MALDI可以有效地分析具有不同物理化学性质的复杂肽混合物或蛋白质混合物。只要样品能与选定的底物形成稳定的分散体系，MALDI就可用于分析。MALDI不受样品中包含的添加剂、缓冲剂或盐的影响，其灵敏度也高于其他电离方法。软电离、电喷雾电离和分子激光电离是解决大极性和热不稳定性蛋白质电离和大分子分子量测定的两种“软电离”技术。此外，与以前的质谱技术相比，这两种方法的分析混合物的灵敏度、准确度和复杂性都有显著提高。与生物质谱的两种主要电离方法相比，质量分析器和质量分析器根据荷质比分离带电离子，以记录各种离子的质量数和丰度。质量分析仪的两个主要技术参数是可测量的质荷比的范围(质量范围)和分辨率。扇形磁分析器四极杆分析器离子阱分析器飞行时间分析器傅立叶变换分析器扇形磁分析器不同质荷比的离子在磁场作用下有不同的正向偏转，从而发散离子束。由于具有不同质荷比的离子在扇形磁场中具有它们自己的运动曲率半径，通过改变磁场强度来检测依次通过狭缝出口的离子，从而实现离子的空间分离并形成质谱。四极分析器，离子束聚焦在平行于棒电极的轴上，直流固定电压(DC)和射频电压(射频)作用在棒电极上，两对电极之间的电势是相反的。对于给定的DC和射频电压，具有特定质荷比的离子在轴向上稳定移动，而具有其他质荷比的离子与电极碰撞并湮灭。离子阱分析仪由两个端盖电极和位于它们之间的四极杆状环形电极组成。势能阱(离子阱)可以通过向端盖电极施加DC电压或接地以及向环形电极施加射频电压来形成。根据射频电压的大小，离子阱可以捕获一定质量范围内的离子。离子阱可以储存离子。离子积累到一定量后，环形电极上的射频电压增加。离子按照质量从高到低的顺序离开离子阱，并被电子倍增器监视器检测到。飞行时间分析仪，具有相同动能和不同质量的离子由于它们不同的飞行速度而被分离。如果离子的飞行距离是固定的，不同质量的离子的飞行时间是不同的，质量小的离子的飞行时间短，先到达探测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。飞行时间分析仪的特点是，飞行时间质量分析仪的结果简单，易于转换，蛋白质离子在飞行管中的飞行速度只与他的(m/z)-1/2成正比，因此很容易通过计算蛋白质离子在飞行管中的飞行时间来计算蛋白质离子的m/z值。与传统的质量分析仪相比，它更容易获得高分辨率和高测量精度。速度快，离子飞行时间只有几微秒左右；质量范围宽，可以直接检测到几十万道尔顿的单电荷离子。飞行时间质量分析仪被认为是21世纪最有前途的质量分析仪。傅里叶变换分析仪显示，在一定强度的磁场中，离子做圆周运动，离子轨道受到共振变换电场的限制。当转换电场的频率与回旋频率相同时，离子稳定加速，轨道半径变得越来越大，动能变得越来越大。当电场消失时，沿着轨道飞行的离子在电极上产生交流电。离子质量可以通过分析信号频率来获得。用计算机通过傅里叶变换将时间和相应的频谱转换成质谱。其优点是分辨率高，荷质比精确到1/1000道尔顿。质量分析器将具有特定m/z值的离子撞击到检测器上，检测器上产生的放大电流可以作为时间的函数来测量离子强度(丰度)和m/z。检测器可以测量离子源产生的离子的相对强度，结果通常以m/z值作为横坐标，以离子的相对丰度作为纵坐标。检测器，质谱通常可以用两种形式表示，一种是以正常化或相对丰度(%RA)的形式表示，另一种是以总离子流百分比(%TIC)的形式表示。在标准化质谱中，最高的峰(例如，最丰富的离子，不一定是要研究的分析物)被称为基底峰，其高度被定义为100个单位。光谱中其他峰的相对高度根据该峰进行归一化，它们的相对高度每次在0到100个单位之间。串联质谱，其中两个或多个质谱连接在一起，被称为串联质谱。最简单的串联质谱由两个串联的质谱仪组成。第一质量分析器(MS1)预分离离子或用能量改变离子，第二质量分析器(MS2)分析结果。串联质谱的最基本功能包括能够解释MS1中的母离子和MS2中的子离子之间的关系。根据MS1和MS2的扫描方式，如亚离子扫描、母离子扫描和中性碎片损失扫描，可以找出不同质量数离子之间的关系。最常用的方法是用低能碰撞诱导的碎裂、低能碰撞诱导的解离、CID或碰撞辅助的碎裂(Col 1 isionalyassisteddiscination，CAD)轰击初级质谱的分子离子(该图称为MS1)和惰性原子，以获得碎片图(MS