菌种管理

,菌 种,基本概念：标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。,菌种 菌种保藏的概念,菌种保藏机构目前世界上约有 550个菌种保藏机构。国外的菌种保藏机构：世界菌种保藏联合会(WFCC)美国菌种保藏中心(ATCC)美国农业部“北部地区研究实验室” (NRRL)英国“国立标准菌种收藏所” (NCTC)英国“国际真菌研究所” (CMI)荷兰“真菌中心保藏所” (CBS)日本微生物菌种保藏联合会(JFCC),菌种 菌种保藏的概念,我国的菌种保藏机构普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)农业微生物菌种保藏管理中心(ACC)工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)抗菌素菌种保藏管理中心(CACC)兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)专利微生物菌种保藏管理中心,菌种 菌种保藏的概念,中国药典2015年版实验室认可准则其他行业标准,菌种 菌种保藏和使用的法规,中国药典2015年版药品微生物实验室规范指导原则中对菌种有了较为明确的规定允许使用标准菌株和商业派生菌株标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活标准储备菌株应进行纯度和特性确认标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株,菌种 菌种保藏和使用的法规,菌种保存的原理是根据菌种的生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。因此低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。,菌种 菌种保存的原理,选择适宜的培养基培养温度和菌龄以便得到健壮的细胞或孢子保存于低温隔氧干燥避光的环境中尽量降低或停止微生物的代谢活动减慢或停止生长繁殖不被杂菌污染在较长时期内保持著生活能力。,菌种 菌种保藏的要点,菌种保存方法有多种，如琼脂斜面低温保存法、液体石蜡保存法、干燥（沙土）保存法、冷冻真空保存法、浓氮超低温保存法等。但对不同的微生物应通过保存试验来选择最适宜的保存方法。注意事项：保存的菌种均应是新鲜纯菌培养物，至少应是第三代的培养物。不同细菌用不同培养基，定期检查菌种保存环境做好记录。,菌种 菌种保藏的方法,琼脂斜面低温保存法：此方法是实验室菌种最常用的保存方法，具有操作简便，使用方便的优点。具体方法是：用无菌的接种环挑取菌株一环，划线于适宜的琼脂斜面（细菌为营养琼脂斜面、真菌为改良马丁琼脂斜面）上，细菌置37培养1824小时，真菌置25培养1824小时。,菌种 菌种保藏的方法,矿油封藏法： 将化学纯的液体石蜡(矿油)经高压蒸气灭菌放在40恒温箱中蒸发其中的水分然後注入斜面培养物中使液面高出斜面约 1厘米。将试管直立放在15-20室温中保存。由于在斜面培养物上覆盖一层液体既能隔绝空气又能防止培养基因水分蒸发而干燥可以延长菌种保藏的时间。但注入的液体必须不与培养基混溶对菌种无毒不易被利用和挥发。此法适用于酵母菌芽孢杆菌不适用于固氮菌乳酸杆菌明串珠菌法门氏菌和毛黴目中的大多数属种。此法简便易行但必须注意防火和污染,菌种 菌种保藏的方法,甘油冷冻管保存法：用无菌接种环挑取菌种接种在相应的琼脂培养基斜面上，置适宜的培养条件培养后，加入含0.05%聚山梨脂80的胰酪大豆胨液体培养基35ml，并通过接种环轻轻刮取菌苔，使细菌充分扩散，制成菌悬液，再加入等体积的、浓度为20%的无菌甘油溶液，轻轻振摇，最后分装于无菌小试管中，置-30条件下保存，-80保存效果更佳,菌种 菌种保藏的方法,此法应注意菌悬液的浓度应高一些，另外甘油的浓度不宜过高，否则影响细菌细胞渗透压，引起细菌死亡。厌氧菌不宜用此法保存。,菌种 菌种保藏的方法,沙土管法：将沙或土过筛烘干装管灭菌然後将菌种制成孢子悬液滴入其中混匀放到盛氯化钙的干燥器里吸除水分干燥後保存或用火焰封管後保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态可保存较长时期。此法适用于芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌镰刀菌等。,菌种 菌种保藏的方法,冷冻真空干燥法：将细胞悬液每0.1-0.2毫升注入一无菌安瓿瓶于-40预冻1小时再于-20-30真空度为13.3帕的条件下脱水。在脱水过程後期安瓿瓶外温度可逐渐升至25。脱水後的样品含水量应在 3以下。最後将安瓿瓶保持真空度 1.3帕用火焰溶封置10保存。为防止细胞在冻结和脱水过程中损伤或死亡要用保护剂制备细胞悬液。保护剂有脱脂牛奶血清10蔗糖或葡萄糖溶液等其作用是通过氧和离子键对水和细胞所产生的亲合力来稳定细胞成分的构型。此法适用于病毒衣原体枝原体细菌放线菌酵母菌丝状真菌等的长期保存是当前保藏菌种的一个重要方法。但是盐杆菌发光杆菌黏杆菌阿舒囊黴多囊黴担子菌中的大多数属种不适用于此法保存。,菌种 菌种保藏的方法,液态氮超低温冻结法： 用甘油或二甲亚砜(DMSO)作保护剂制备细胞悬液分装入无菌安瓿瓶每管0.2毫升在控制温度下降速率为1/分钟的条件下预冻至-40然後立即放入液氮生物贮存罐中气相(-150)保存。恢复培养时先直接侵入38水浴中解冻 510分钟再种植于适宜培养基内培养。这是根据在低于-130时一切生化反应处于停止状态微生物也不能进行代谢活动而设计的冻结法。为避免冻死冻伤和细胞内形成大量冰晶用保护剂制备悬液并控制预冻时的冷却速率和解冻时融化速率。微生物的大多数属种适于慢速冻结和快速解冻。此法适用于病毒枝原体各种细菌放线菌酵母菌丝状真菌蓝藻等。,菌种 菌种保藏的方法,实验室常用的菌种保存方法：保存媒介：甘油冷冻管琼脂斜面培养基瓷珠保存管保存温度：甘油冷冻管和瓷珠保存管均在-30或-80 琼脂斜面培养基在48,菌种 菌种保藏的方法,菌种的申购菌种的复苏菌种的传代菌种的保藏菌种的使用和销毁,菌种 菌种管理,菌种的申购每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年度菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。所购菌种均为冷冻干燥菌种。 采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，置4-6暂存。,菌种 菌种管理,菌种的复苏：培养基：胰酪大豆胨液体培养基(TSB)；沙氏葡萄糖液体培养基 (SDB)；胰酪大豆胨琼脂培养基 (TSA)；沙氏葡萄糖琼脂培养基 (SDA)；梭菌增菌培养基。培养温度：细菌：3035真菌：2025,菌种 菌种管理,菌种 菌种管理,菌种复苏：操作流程,菌种的确认: 划线于选择性培养基革兰氏染色适宜的生化实验全自动微生物鉴定仪工作用菌种的制备：选择性培养基上的典型菌落分别划线于相应的琼脂斜面上,菌种 菌种的确认及工作用菌株的制备,稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液黑曲霉：含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液。稀释方式：10倍递增稀释菌液制备后：室温下放置，应在2小时内使用；28 可在24小时内使用。黑曲霉的孢子液可保存在28 ，可在验证过的储存期内使用。,