脂环酸芽孢杆菌(_Alicyclobacillus)PPT演示课件

脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)的检测与控制,严纪文Jiwen.y,1,概述,脂环酸芽胞杆菌(Alicyclobacillus)是脂环酸芽胞杆菌属，革兰阳性(仅有一株为革兰阴性)的芽胞杆菌。人们根据其耐热、耐酸的特性，俗称为耐热菌、耐热耐酸菌、嗜热耐酸菌、嗜酸耐热菌等。已有文献报导：脂环酸芽胞杆菌是引起果汁、酸性饮料(尤其是巴氏灭菌的果汁)腐败变质的主要元凶。,2,1998年美国国家食品生产者联盟(NFPA)经过调查发现，美国35%的果汁腐败都与嗜酸的芽胞杆菌有关。嗜酸耐热菌的在芽孢可橙汁中萌发、生长，也可以在30的苹果汁、葡萄汁中生长良好。导致果汁产品腐败的嗜酸耐热菌主要是酸土脂环酸杆菌。引起的果汁腐败变质的主要是它的代谢产物。,3,2000年起，美国及欧洲大部分果汁消费国要求浓缩果汁中脂环酸芽胞杆菌的含量应1CFU/10mL。2002年起，浓缩果汁中对耐热嗜酸菌的要求为不得检出。,4,脂环酸芽胞杆菌引起腐败的初期不易发现，产品并不出现明显的涨包或酸败。因而在低污染时难以检出，但其代谢产物达到万亿分之一的浓度时，就会使果汁口感风味变劣、浊度升高乃至在包装底部形成白色的沉淀等质量危害。其芽胞还可污染生产中的半成品(浓缩果汁)、生产材料(加工水果)、生产设备。,5,Walls等人对酸土环脂芽孢杆菌的致病性进行了研究，他们将含有高浓度酸土脂环酸芽孢杆菌的生理盐水悬菌液0.5ml注射到小鼠腹膜内，小鼠未表现出任何异常现象，证明在受试浓度内该菌不具致病性。用含菌5106CFU/ml的苹果汁饲喂豚鼠，一周后豚鼠仍表现正常。至今未见关于饮用了含脂环酸芽孢杆菌的果汁后导致疾病的病例报道。小结：脂环酸芽胞杆菌虽然可引起饮料变质，但目前未发现其对人致病。,6,愈创木酚愈创木酚，又称邻甲氧基苯酚、2-甲氧基苯酚。是用于食品的合成调味料，它可以产生甜、烟熏和烧烤风味。卤酚溴酚：包括2，6-二溴苯酚(2，6-DBP)和2，6-二氯苯酚(2，6-DCP)，可产生“药味”、“消毒水味”。,脂环酸芽胞杆菌的代谢产物,7,脂环酸芽胞杆菌的分类与命名,1971年Darland和Brock在美国的酸热环境中分离到芽孢杆菌Bacillusacidocaldarius，该菌细胞膜中具有独特的-环己烷脂肪酸结构和藿烷化合物结构；且这种菌只在酸热的环境中存在，将其命名为酸热脂环芽孢杆菌。不久Hippchen等也在土壤中分离到相似的菌株。,8,1984年Cerny等在腐败的苹果汁中分离到一株细胞膜中含-环己烷脂肪酸结构的芽孢杆菌，高度怀疑该菌导致了苹果汁的腐败。1987年Deinhard等对包括前述菌株的13株耐热耐酸菌做了结构分析和全面的鉴定。将其中一株与B.acidocaldarius相似的菌株命名为酸土环脂芽胞杆菌(B.acidoterrestris)。1992年Wistozkey等对这些菌株进行了16SrDNA序列分析将这三株菌从芽孢杆菌属中划分出来，命名为脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)。,9,Churey等人1994年从腐败的苹果汁中发现嗜酸耐热芽胞菌，经鉴定为酸土脂环芽胞杆菌。Splittstoesser等人从腐败的无菌包橙汁中发现2株嗜酸耐热芽胞菌，革兰染色阳性，芽孢耐热性D90为1623min，D95为2.42.8min。,10,脂环酸芽胞杆菌的模式株：A.acidoterrestris酸土环脂芽胞杆菌。19982003年，不断有人从南极、亚速尔群岛、日本仙台火山附近的土壤中分离到这类细菌。至此脂环酸芽胞杆菌属有11个种，1个亚种。该菌属新菌种的发现仍在继续。,11,脂环酸芽胞杆菌的生化特性,可生存在高温、高酸的条件下。最适生长温度为4253，生长pH2.06.0。在某些特殊的培养基中不能生长。如：酸土环脂芽胞杆菌不能生长于含胰酪蛋白胨、牛肉汤琼脂的培养基中，甚至pH达到3.5时也无法生长。菌株在培养基中45需氧培养12d即形成明显的菌落。,12,菌落形态一般为圆形饱满、乳白色、半透明或不透明，直径为0.55mm。菌体形态为杆状，革兰染色阳性，产芽孢，芽孢呈椭圆形，端生或次端生，有时会使菌体细胞膨大，菌体宽0.351.1m、长26.3m。好气生长。,13,对脂环酸芽胞杆菌的生化鉴定常采用API50CHB鉴定系统。API50CHB鉴定系统采用49种碳源(糖、醇)，观察芽胞杆菌对其的利用情况进行编码鉴定。但脂环酸芽胞杆菌的部分菌株之间糖利用情况的差异并不显著，往往需要进一步的鉴定。,14,酸土环脂芽胞杆菌生化反应,15,目前分离脂环酸芽胞杆菌的常用培养基：BAM(BacteriaAcidocaldariusmedium)；OSA(orangeserumagar)；PDA(patatodestroseagar)，但需调节pH至3.5；YSG(yeaststarchglucose)；K氏培养基；SK琼脂培养基等。,16,脂环酸芽胞杆菌的生长温度、pH范围,17,嗜酸耐热菌在不同果汁中的抗热性,18,研究表明：培养基中的阳离子(Ca+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Sr2+)对嗜酸耐热菌的抗热性无影响。有机酸的不同(苹果酸、柠檬酸、酒石酸)对嗜酸耐热菌的抗热性无显著性影响。在8891范围内，当pH值增加约0.6时，D值增加近1倍可溶性固形物的含量会影响嗜酸耐热菌抗热性，在同样温度时，D值随可溶性固形物的增加而增加。但当温度接近97时，影响不明显。,19,脂环酸芽胞杆菌的分布与污染途径,脂环酸芽孢杆菌通常存在于土壤中，在1870生长，pH27存活，当pH4时便生出芽孢成为变异细胞，芽孢的耐热能力为8556min，9015min，952.4min。通过土壤、灰尘、昆虫等附着在果实表面。此外，该菌也可以通过其特殊的细胞结构黏附在果实表面。,20,脂环酸芽胞杆菌检验方法介绍,原理：样品经热处理，去除样品中的非耐热杂菌，取适量样液用0.45um滤膜过滤后，将滤膜贴于培养基中，培养后进行菌落计数，必要时可于显微镜下检查芽孢。仪器：恒温水浴：801。恒温培养箱：401。灭菌培养皿：直径为90mm。灭菌试管：18180mm。滤膜：0.45um水系一次性滤膜。,21,K氏培养基的配制：酵母粉1.25g蛋白胨2.50g葡萄糖0.5g吐温800.5ml琼脂6.50g蒸馏水500ml配制方法：将各成分加入蒸馏水中，溶解后，在121灭菌1525min，冷却至约50时用经过滤除菌的12.5%的苹果酸(1.25g苹果酸加入10ml蒸馏水，溶解后以0.45m滤膜过滤)调节pH3.70.1，倾注平板。平板密封后置05下可保存60d。,22,样品处理-浓缩汁,以无菌操作分别取10ml浓缩汁于二个15ml灭菌的试管中，其中一管插入温度计(温度控制管)。将二样品管置801的水浴中，观察温度控制管中温度计的温度，当温度计读数达到801时，开始计时，维持13min。水面应高于试管中的样品。取出后迅速冷却至室温。,23,用90ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中，摇匀。将稀释后的样品溶液用0.45um的滤膜真空过滤。也可根据样品的污染情况，选择合适的稀释度进行过滤。,24,样品处理-清汁、水,分别取150ml清汁（或水）于二个已灭过菌的玻璃样品瓶中，同上操作。样品冷却至室温，用0.45um的滤膜真空过滤。也可根据样品的污染情况，选择合适的稀释度进行过滤。,25,样品处理-浊汁,分别取20ml浊汁于二个已灭过菌的试管中，同上操作。样品冷却至室温，用0.45um的滤膜真空过滤。也可根据样品的污染情况，选择合适的稀释度进行过滤。,26,培养与计数,用灭菌的镊子，将过滤膜从过滤器上取下放在K氏培养基上，保证滤膜与培养基接触，不能留有气泡。倒置于4041恒温培养箱中，可在恒温培养箱底部放置一个有水的盘子，以调整恒温培养箱的湿度，培养5d。培养结束后，记录该培养温度下滤膜上的菌落数。报告：CFU/10ml。,27,关于脂环酸芽胞杆菌的检验要点,培养基的pH调节：建议使用苹果酸，浓度可在1020%之间。据文献报导培养基的pH在3.70.1时，耐热菌生长良好。如配制200mlK氏培养基，用0.336g苹果酸即可达到pH3.70.1。取样量选择原则：浓缩汁-少取并稀释；成品料-多取，可不稀释或直接过滤。注意样品的代表性(视污染情况而定)。,28,培养基的用量：因本实验的培养时间较长(5d)，所以每皿培养基的用量应在20ml以上，以避免因培养基水分损失造成细菌不生长。热处理的温度与时间：热处理温度多采用801，但也有采用7476进行热处理。热处理时间：1020min都有人选择。选择原则：接近巴氏灭菌的温度与时间，的或产品生产工艺要求的温度与时间。,29,培养时间与温度：培养温度：在4045，可根据样品中污染情况选择适宜的培养温度。培养时间：多数为5d，也有35d。但培