第5章--免疫血清学检验技术.ppt

第五章免疫血清学检验技术,第一节凝集与沉淀反应第二节放射免疫测定技术第三节免疫荧光技术第四节酶免疫测定第五节固相膜免疫测定,凝集反应：细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象。,一、凝集反应及其特点,第一节凝集与沉淀反应,凝集反应过程：抗原抗体的特异性结合出现肉眼可见的凝集现象凝集反应特点：IgM的作用比IgG大数百倍IgG与抗原结合后，常不出现凝集现象，称不完全抗体临床意义：进行细菌的抗原分析、鉴定及分型，也可应用已知细菌检查未知血清的抗体。,多克隆抗体,单克隆抗体,肌红蛋白,上清液,肉眼可见的凝集现象,直接凝集反应(directagglutination)：颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。,二、直接凝集反应,（一）玻片凝集试验,方法评价:定性试验简便和快速敏感度低,临床应用:菌种鉴定血清学分型血型鉴定,（二）试管凝集试验,方法评价：半定量试验简便、快速敏感度低可有假阳性,临床应用：肥达氏试验：伤寒副伤寒外裴二氏试验：斑疹伤寒Wrighttest:布鲁菌病交叉配血试验,间接凝集反应(indirectagglutination)：将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面，然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。载体种类：RBC（醛化）；聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化）；金黄色葡萄球菌。,三、间接凝集反应,用抗原致敏载体-检测抗体,（一）间接凝集反应的类型,1、正向间接凝集试验,用抗体致敏载体-检测抗原,2、反向间接凝集试验,用抗原致敏载体-检测抗原,3、间接凝集抑制试验,coagglutinationtest：以金黄色葡萄球菌菌体为反应的载体。人及多种哺乳动物（猪、兔、豚鼠等）血清中IgG抗体的FC段与菌体表面的A蛋白（SPA）非特异性结合后，IgG的两个Fab段仍然暴露在菌体表面，保持着结合抗原的活性和特异性。当与特异性抗原相遇时，能出现特异的凝集现象。SPA-(Fc)IgG(Fab)-AbSPA：staphylococcalproteinA,4、协同凝集试验,（二）正向间接血凝试验,血凝试验强度,正向间接血凝试验,（三）反向胶乳凝集试验,将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明胶颗粒上，当致敏颗粒与样品血清作用时，若血清含有抗病毒抗体则可形成肉眼可见的粉红色凝集,（四）明胶凝集试验,抗原的检测反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。抗体的检测检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体。,（五）间接凝集反应的应用,未经致敏的受检者新鲜红细胞试剂：抗人O型红细胞的单克隆抗体临床应用：HIV检测、HBV检测,四、自身红细胞凝集试验,五、抗球蛋白试验（Coombs试验）,（一）直接Coombs试验,检测红细胞上的不完全抗体,（二）间接Coombs试验,检测血清中的不完全抗体,可溶性抗原(如细菌、外毒素、血清蛋白等)与相应抗体特异性结合后，在一定条件(适量的电解质、合适的酸碱度和温度)下，经一定时间，于比例合适处形成肉眼可见的沉淀现象。,六、沉淀反应precipitationreaction,（一）单向琼脂扩散试验,制成含有适宜抗体浓度的琼脂凝胶板。以适当距离打孔，孔中加入可溶性抗原。抗原向周围扩散，当抗原与抗体比例适宜时，在琼脂中形成抗原抗体复合物的晶格和沉淀。沉淀环的直径与抗原浓度呈正相关。扩散圈出现呈两重沉淀环的双环现象，表明存在但抗原性相同，而扩散率不同的两种组分。,大分子抗原和长时间扩散（48h）：C=kd2小分子抗原和较短时间（24h）：logC=kd,（二）双向琼脂扩散试验,可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周扩散，若两者分子比例适当，则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线。,加入定量的抗体在中间孔，按一定距离在四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的抗原可见粗细不等的沉淀线，从而可判定抗原的效价。,三孔型双向免疫扩散可能的结果,（三）对流免疫电泳试验,概念:在电场中进行的双向免疫扩散。原理:将抗原加至近阴极孔内，抗体加至近阳极孔内。抗原与抗体在pH8.6的缓冲液中均带负电荷，通电后，抗原因带负电荷向阳极泳动，而抗体球蛋白等电点高，所带负电荷少，加之分子量较大，向阳极的位移小于受电渗作用向阴极的位移，形成抗原抗体相向移动。二者结合，在比例适宜处形成白色沉淀线。优点:快速，只需1小时左右；灵敏度提高，约为10gml。,（四）火箭电泳RocketElectrophoresis,又称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。,火箭电泳示意图,早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析。,第二节放射免疫测定技术,常用标记核素,一、放射免疫分析,1、基本原理：Ab限量，Ag*定量，Ag*与Ag具有等同的与Ab结合能力，且两者的总量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低，二者变化成函数关系。,以未结合的Ag*为F，Ag*-Ab复合物为B，则B/F或B/T(BF)与Ag的量变存在着剂量-反应曲线。,2、实验方法及测定,Ag*,Ag,平衡非平衡一步法二步法,Ab,体积温度时间pH,Ag*-标准；Ag-样品,二抗体沉淀法,PEG沉淀法,PR试剂法,活性炭吸附法,分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响操作应简单、重复性好经济,结合与游离标记物的分离,二、免疫放射分析,1、基本原理：以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。,2、单位点IRMA,先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合游离的标记抗体并将其分离,测定上清液的放射量,3、双位点IRMA,先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。,IRMA与RIA比较,将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。,第三节荧光免疫技术,（一）荧光免疫分析的基本原理,均相荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定,非均相荧光免疫测定荧光偏振免疫测定,荧光免疫技术,荧光免疫技术的类型,荧光免疫测定液体样品测定,荧光抗体技术固体样品测定,直接法间接法双标记法,荧光免疫测定中常用的荧光物质,时间分辨检测原理示意图,（二）时间分辨荧光免疫测定,1、基本原理,镧系元素铕(Eu3+)（最常用）；钐(Sm3+)；铽(Tb3+)；钕(Nd3+)；镝(Dy3+),2、标记物,常见荧光物质的荧光寿命,3、信号增强作用,固相双抗体夹心法原理示意图,固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物在酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。,4、双抗体夹心法,待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。,5、固相抗体竞争法,待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。,6、固相抗原竞争法,荧光偏振免疫测定原理示意图,（三）荧光偏振免疫测定,荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图,酶标记抗体或抗原，与固相载体包被的抗原或抗体特异性结合。洗去游离的酶标物。加入底物，经酶分解后生成荧光产物。,（四）荧光酶免疫测定,荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物,固相抗体和酶标记抗体与待检抗原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。,1、双抗体夹心法,荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图,固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。,2、双抗原夹心法,待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。,3、固相抗原竞争法,抗核抗体(均质型),抗核抗体(核膜型),抗核抗体(斑点型),（五）荧光酶免疫技术的应用,1、自身抗体检测,寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）,细菌（藤黄微球菌),2、病原体检测,肿瘤（人肝癌细胞）,3、免疫病理检测,4、细胞表面抗原和受体检测,荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。,酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,第四节酶免疫测定,一、基本原理,（一）常用的酶及其底物,1、辣根过氧化物酶（HRP）多用于ELISA方法。四甲基联苯胺TMB。反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性。2、碱性磷酸酶（AP）对-硝基苯磷酸酯（pNPP）。经酶作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。3、-半乳糖苷酶（-Gal）多用于均相酶免疫测定。4MUG。经酶作用后生成高强度荧光物，用荧光计测量。,（二）固相载体及其处理,1、常用的固相载体塑料制品、微颗粒、膜载体。通过固相载体可以方便的将非均相酶免技术中游离的和结合的抗体（或抗原）酶标记物迅速分离。,2、固相载体的处理包被（coating）：将抗原或抗体结合于固相载体。封闭（blocking）：用1%-5%的牛血清白蛋白或5%-20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均相,非均相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片或其它标本中抗原的定位,液体标本中抗原或抗体的定性和定量,（三）酶免疫技术分类,均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛。常用于传染病的诊断：病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒；结核杆菌、幽门螺杆菌。也用于一些蛋白质的检测：各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原）。,（三）酶免疫测定的应用,酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。常用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定。,二、均相酶免疫测定,1、酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique,2、克隆酶供体免疫分析CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay,三、酶联免疫吸附试验Enzyme-linkedimmunosorbentassay,（一）基本过程及试剂,1、包被：固相的抗原或抗体2、反应：加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。酶标记物（酶结合物）3、洗涤：使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离4、底物显色：定性或定量的分析。酶反应的底物,1、双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,（二）ELISA检测抗原的方法,双抗体夹心法测抗原,2、竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）,竞争法测抗原,1、间接法方法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点：一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。应用：常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定。,（三）ELISA检测抗体的方法,间接法测抗体,2、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体,3、竞争法原理：类似检测抗原的竞争法应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测,应用于病原体急性感染诊断中的IgM型抗体、甲型肝炎HAV-IgM抗体、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体的检测。,原理：抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色,4、捕获法,捕获法原理,第五节固相膜免疫测定,一、常用的固相膜及其特点,玻璃纤维素(fiberglass)，尼龙(nylon)，聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)，硝酸纤维素(nitrocel