分子生物学-蛋白质

第二章,蛋白质的结构与功能,Structure and Function of Protein,任何一个蛋白质分子，在其天然状态或活性形式下，都具有特定的基本结构和独特而稳定的空间构象，这是蛋白质分子在结构上的一个最显著的特征。 我们要研究蛋白质的功能，就必需要研究蛋白质的结构，不仅要研究其一级结构，还要了解其空间构象，这样才能全面而深入的阐明蛋白质结构与功能的相互关系。,自然界中存在着数千种蛋白质，他们各具有不同的生物学功能，这是由不同的化学结构所决定的。,Structure and Function of Protein,一、蛋白质的一级结构与功能,（一）蛋白质的一级结构:,（二）蛋白质的一级结构与功能的关系,某些蛋白质一级结构中有一些特定的序列能阻碍蛋白质表现出生物功能，只有将其切除后才能形成有活性的蛋白质。也有些蛋白质因一级结构序列的差异可能影响蛋白质的正常功能而引起疾病。,是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，是由基因上的遗传密码所决定的，又称蛋白质的基本结构，是蛋白质分子结构的基础，它决定蛋白质空间结构的所有层次。,（一）活性蛋白质与前体,许多活性蛋白质都有一个不具有生物活性的前体，需经专一性蛋白酶的限制性水解，切去一个或几个肽段，才能转变成有活性的蛋白质。 许多激素，如：胰岛素、甲状腺素、生长激素和胰高血糖素等均存在激素前体。 另有多种蛋白水解酶和凝血酶也都是由其前体酶原转变而来。 前体蛋白均无生物活性。,胰岛素前体及其激活,人的胰岛素最初由胰腺细胞合成时，是一条由110个氨基酸残基组成的前胰岛素原肽链； 其N端有一个约24个氨基酸残基组成的信号肽，富含疏水氨基酸，因此可穿过内质网膜，将新生肽链输送到内质网腔，经内质网膜上的信号肽酶作用，剪去信号肽序列，形成胰岛素原（proinsulin) 胰岛素原是一条有86个氨基酸残基组成的多肽链，B 链在前，A 链在后，C 链连接肽插在中间 当胰岛素原在高尔基体包装并分泌时，A 、B 链间的 C 链才被切除，生成由A链与B链组成的具有生物活性的胰岛素。,胰岛素前体的激活,前胰岛素原,1,24,110,信号肽酶,胰岛素原,1,86,31，32,胰蛋白酶,64，65,信号肽,B链,C链,A链,A链,B链,S-S,S,S,21,30,C链,31,C肽（无活性）,类羧肽酶H,胰岛素（有活性）,高尔基体,胰岛细胞核糖核蛋白体,（二）蛋白质一级结构与分子病,蛋白质一级结构发生改变，甚至只有一个氨基酸残基发生改变，即可使蛋白质功能发生改变，严重时可导致疾病。这种由于基因突变而导致蛋白质一级结构改变后表现出生理功能异常，使机体出现病态现象，称为分子病。镰刀状红细胞贫血病是最早被认识的一种分子病。,1949年Pauling发现镰刀状红细胞贫血病是由于患者红细胞中含有一种异常血红蛋白（HbS)所致。,1956年Ingram采用指纹图谱分析其一级结构，发现HbS与正常人HbA的一级结构仅有一个氨基酸的差异，正常HbA的-链N端第六位氨基酸为谷氨酸，在病人HbS中，N端第六位谷氨酸被缬氨酸所取代（谷缬）其他完全相同。,这种Hb分子一级结构的微小改变，使原来处于分子表面的含有可解离基团侧链的谷氨酸被具有疏水性侧链的缬氨酸取代，从而使HbS的亚基表面形成局部疏水区，称为粘斑。这种Hbs在氧分压低的情况下进行线形缔合，形成纤维状沉淀，导致与氧的亲和力降低，并使RBC被扭曲成镰刀状，可塑性下降，容易破裂溶血。,蛋白质的空间结构包括：二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure),二、蛋白质的空间结构与功能,（一）蛋白质的二级结构:,是指多肽链骨架中各原子的局部空间排布，也就是多肽链中氨基酸残基的相对空间位置，是多肽链主链骨架中的若干肽段所形成的有规则的空间排布。 如-螺旋，-折叠，-转角和无规则的空间排布。显然，它只关系到蛋白质分子主链原子的空间排布，而不涉及侧链的构象以及与其他肽段的关系.,(二)超二级结构:,是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次，是指在多肽链内，一些二级结构单元在三维折叠中彼此靠近，相互作用，从而形成有规则的二级结构聚合体，可作为结构域的组成单位或直接充作三级结构的“建筑块”。这种二级结构聚合体称为超二级结构。目前发现的超二级结构有三种基本结构形式:,1.-螺旋组合体():是由2个相邻的-螺旋聚集而成，这种组合非常稳定，主要存在于-角蛋白和原肌球蛋白等纤维状蛋白中。,2.-折叠组合体():是由3个或3个以上相邻的-折叠聚集而成。他们之间互相以短链相连。若由多条-折叠所构成的-折叠片，可卷曲成圆筒状结构。如超氧化物歧化酶的-折叠筒含8条-折叠。,3.-螺旋-折叠组合体:()是由一个-螺旋和与之首尾相邻的两个-折叠聚集而成。有时可由两组聚合在一起，形成更复杂的超二级结构。主要存在于球蛋白中，如LDH。,（三）结构域:,在一些相当大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成在三维空间上明显区别的局部区域，称为结构域。 结构域一般由100200个氨基酸残基组成，具有独特的空间结构，并具有不同的生物学功能。 较大的蛋白质分子可含有两个或多个结构域，如木瓜蛋白酶含有2个结构域；IgG含有12个结构域。 一个蛋白质分子中的几个结构域有的是相同的，如硫氰酸酶的2个结构域是相同的；有的则是不同的，如木瓜蛋白酶的2个结构域不相同。 不同蛋白质中也可有相似的结构域，如LDH和苹果酸脱氢酶都以NAD+为辅酶，都由2个不同的结构域组成，其中与NAD+结合的结构域是基本相同的。,（五）蛋白质的三级结构:,是指一条多肽链中所有原子的空间排布，这条多肽链可以是完整的蛋白质分子，也可以是多亚基蛋白质的亚基。 也可以说，具有二级结构、超二级结构或结构域的一条多肽链，由于顺序上相隔较远的氨基酸残基侧链的相互作用，而进行范围广泛的盘曲和折叠，形成包括主、侧链在内的空间排布。 这种由一条多肽链所形成的三维空间的整体排布称为三级结构。,（六）模序（模体motif）,随着蛋白质三级结构研究的进展，在许多蛋白质分子中，可发现2个或3个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成立体形状或拓扑结构颇为类似的，具有特殊功能的局部区域，被称为模序。 每个模序都有特征性的氨基酸序列，并发挥特殊功能。 如：钙结合模序、锌指模序、亮氨酸拉链。都具有结合DNA的功能。,钙结合蛋白中结合钙离子的模序,锌指模序,碱性亮氨酸拉链,（七）蛋白质的四级结构:,许多蛋白质分子作为一个活性单位时，是由两条以上的多肽链组成，这些多肽链都有各自的三级结构，称为蛋白质分子的亚基。 有二个或二个以上亚基借非共价键聚合在一起就形成蛋白质的四级结构。 分子量在55000以上的蛋白质几乎都有亚基。亚基虽然具有三级结构，但单独存在时均无生物活性，只有聚合成完整的四级结构才具有生物活性。,是指亚基的立体排布、亚基间相互作用和接触部位的布局。,（八）蛋白质空间结构的折叠,蛋白质翻译的产物多肽链必须正确的折叠才能形成具有天然构象的蛋白质。 新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成，新生肽链N-端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模序、结构域到形成完整空间构象。,蛋白质折叠的研究，比较狭义的定义就是研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定性和与其生物活性的关系。在概念上有热力学和动力学的问题。,几种有促进蛋白质折叠功能的大分子:,1.分子伴侣 (molecular chaperon) 2.蛋白质二硫键异构酶 (protein disulfide isomerase, PDI)3.肽-脯氨酰顺反异构酶 (peptide prolyl-cis-trans isomerase, PPI),细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶和蛋白质辅助，指导新生蛋白质按特定方式进行正确的折叠。,1. 分子伴侣: （ molecular chaperon）,分子伴侣（ molecular chaperon）是细胞内一类可识别肽链的非天然构象、促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠的保守性蛋白质。,分子伴侣有以下功能：,封闭待折叠蛋白质所暴露的疏水区段；创建一个隔离的环境，可以使蛋白质的折叠互不干扰；促进蛋白质折叠和去聚集；遇到应激刺激，使已折叠的蛋白质去折叠。,(1) 热休克蛋白(heat shock protein, HSP) (2) 伴侣蛋白(chaperonin),分子伴侣主要有：,(1) 热休克蛋白(heat shock protein, HSP),性质：热休克蛋白属于应激反应性蛋白质，高温应激可诱导该蛋白质合成。种类：大肠杆菌的热休克蛋白包括：HSP70、HSP40和GrpE三族。作用：可促进需要折叠的多肽折叠为有天然空间构象的蛋白质。,它有两个主要功能域：一个是存在于N-端的高度保守的ATP酶结构域，能结合和水解ATP；另一个是存在于C-端的多肽链结合结构域。蛋白质的折叠需要这两个结构域的相互作用。在蛋白质的折叠过程中，HSP70还需2个辅助因子HSP40和Grp E。,大肠杆菌的HSP70 (DnaK，基因DnaK编码),可激活Dna K中的ATP酶，生成稳定的Dna J -Dna K-ADP-被折叠蛋白质复合物，以利于Dna K发挥分子伴侣作用。在ATP存在的情况下，Dna J和Dna K的相互作用能抑制蛋白质的聚集。,Grp E,核苷酸交换因子，与Dna K的ATP酶结构域结合，使Dna K的构象发生改变、ADP从复合物中释放出来并由ATP代替ADP，从而控制Dna K的ATP酶活性。,HSP40 (Dna J),大肠杆菌中的HSP70 反应循环,伴侣蛋白,(2) 伴侣蛋白(chaperonin),伴侣蛋白是分子伴侣的另一家族，如大肠杆菌的Gro EL和Gro ES（真核细胞中同源物为HSP60和HSP10）等家族。其主要作用是为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,当待折叠肽链进入Gro EL的桶状空腔后，Gro ES可作为“盖子”瞬时封闭Gro EL空腔出口。封闭后的桶状空腔提供了能完成该肽链折叠的微环境。,Gro EL-Gro ES复合物,14个相同亚基构成多聚体，每7个亚基围成一圈，上下两圈堆砌成桶状空腔，顶部是空腔出口。,可作为“盖子”瞬时封闭Gro EL空腔出口。,Gro EL-Gro ES反应循环,（九）蛋白质空间结构与功能的关系,酶是具有催化活性的蛋白质，同样具有一、二、三级结构，有些酶还具有四级结构。 自然界的酶有数千种，各种酶都具有特异的催化功能，这是由于各种酶的空间结构，特别是酶活性中心的空间构像不同所决定的。 酶活性中心的空间构象是酶表现活性的关键部位，不同酶活性中心的空间构象不同，因而具有特异的催化活性。 酶活性中心空间构像的维持依赖于酶蛋白的二、三级结构的完整性。当酶受到各种变性因素作用时，酶蛋白空间结构破坏，活性中心的构像改变，酶失去催化活性。,1.酶的空间结构与催化功能的关系,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,核糖核酸酶的变性和复性,2.与蛋白质错误折叠有关的疾病,有些蛋白质肽链错误折叠后会相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，对机体产生毒性而发病。如：纹状体脊髓变性病，老年痴呆症，疯牛病，柏金森氏病等。有许多神经性疾病, 淀粉样蛋白聚集在脑中 ,最常见的是老年性痴呆症。在患有老性痴呆病人的脑中,塞满了由错误折叠蛋白质形成的杂乱的蛋白质簇。,（1）蛋白质构象疾病：若蛋白质的肽链折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。此类疾病被称为蛋白质构象疾病。又称为“折叠病”。,（2）疯牛病的发病机理：,疯牛病可以通过食用病肉而被感染，它是由一种被称为朊病毒的蛋白质（prion protein, PrP)感染引起的人和动物神经系统疾病。 这类疾病具有传染性、遗传性或散在发病的特点，其在动物间的传播是由PrP组成的传染性颗粒（不含核酸）完成的。 PrP是染色体基因编码的蛋白质，人类PrP基因位于20号染色体短臂上，编码253个氨基酸。正常人和动物PrP为分子量3335kD的蛋白质，其中-螺旋结构占整个分子的40%，-片层结构很少甚至没有。其水溶性强，对蛋白酶敏感，称为PrPc 。,富含-螺旋PrPc在某种X蛋白(可能是一种伴侣蛋白，帮助介导蛋白质折叠）的作用下可转变成全为-折叠的致病性PrP，称为PrPsc。在正常机体中， PrP是神经活动所需的蛋白质 , 而致病PrP与正常PrP的一级结构完全相同 , 仅空间结构不同。说明由正常状态向致病状态转化涉及到蛋白质构象变化或翻译后修饰。,重新折叠,在体内，外源的或新生的PrPsc可作为模板，通过复杂的机制使细胞内正常的仅含-螺旋的PrPc重新折叠成为仅含-折叠的致病性PrPsc。,以疯牛病为代表的多种折叠病的发病机理足以证明蛋白质空间结构与其功能的密切关系。,PrPsc能抗蛋白水解酶，水溶性差，对热稳定，可以相互聚集，最终形成淀粉样纤维沉淀，而导致疾病发生。,三.蛋白质蛋白质相互作用,在生物体内，相同或不同蛋白质分子之间以及蛋白质与配体之间存在着相互作用，这对于机体的生理活动具有重要意义,（一）分子与亚基的聚合,有些蛋白质其分子或亚基能进一步缔合。如胰岛素单体（Ins）在溶液中能发生下列聚合反应：,2Ins,Ins2,(二聚体),2Ins2,2Ins2,(四聚体),3Ins2,3In2,(六聚体),单体不同于亚基，因而聚合体不属于四级结构。多聚体分子形式的存在具有一定的意义，如胰岛素六聚体不易被蛋白酶水解失活。,蛋白质分子或亚基因聚合方式不同，形成4种不同形式的聚合体。,4.螺旋状聚合体：聚合体呈螺旋状。如：烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白由2130个亚基组成，亚基排列成右手螺旋，每圈含16.3个亚基，螺距2.5nm，螺旋长度300nm。,1.线性聚合体：分子成线性聚合，聚合度可很大。线性聚合与许多蛋白质的生理功能有关。例如：机动蛋白与肌球蛋白，各自线性聚合成细丝和粗丝，细丝和粗丝的相互作用，引起肌肉收缩。,2.环状聚合体：聚合体呈环状，具有对称性。例如：电镜下观察到钼铁蛋白四个亚基呈环状对称排列,3.多面体聚合体：蛋白质分子的各个亚基排列在多面体的各个顶点或边上，形成一种多面体结构。,(三）不同蛋白质分子间的聚合,不同蛋白质分子间的聚合在生物学上有着重要的意义。例如：抗原与抗体结合产生免疫反应；蛋白质类激素与相应受体结合发挥生物学效应；功能相关的酶分子聚合在一起，形成具有一定结构的多酶复合体，发挥重要催化作用。如：丙酮酸脱氢酶复合体。,（五）分子识别,在不同的生物大分子之间，普遍存在着一种专一性结合现象，例如：酶与底物；激素与受体；抗原与抗体以及调节蛋白与DNA之间的专一性结合。生物大分子之间的这种专一性结合称为分子识别。,（四）分子自我装配,某些细胞器、细胞器碎片以及病毒，在拆散成各组分-蛋白质、核酸、糖类以及其它成分后，在特定条件下，又能自动装配成具有原来生物学功能的细胞器、细胞器碎片和病毒。这种过程称为自我装配。,四、蛋白质一级结构的测定：,蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构和功能。所以测定其一级结构具有重要意义。自1955年英国科学家F.sanger首次完成牛胰岛素氨基酸序列测定至今，已有上千种蛋白质的一级结构被测出。,(一)蛋白质测序的策略,1.确定蛋白质的纯度在97%以上。2.测定多肽链的数目。3.拆分多肽链。4.分析每一条多肽链的氨基酸组成。5.鉴定多肽链的N末端和C末端氨基酸残基。6.用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。7.测定各肽段的氨基酸序列。8.拼接各肽段成完整的多肽链。9.确定二硫键的位置。,(二)蛋白质测序的方法,1.样品的处理：,测序蛋白质的纯化：测序蛋白质首先要采用合适的方法进行纯化，如：凝胶层析、例子交换层析、离心等。使其杂蛋白不超过5%。,测定蛋白质的分子量：采用电泳、层析或离心等方法测出测序蛋白质的分子量，以估算其氨基酸的数目。,2.氨基酸组成分析：,为了确定蛋白质的氨基酸组分，先要将蛋白质样品水解，然后定量分析其氨基酸种类和数目。由于没有一种能使肽链完全水解而所有氨基酸不被破坏的方法，因而常采用几种不同的水解方法，以确保每种氨基酸能正确测定，常用的水解法有酸、碱和酶解法三种。,酸解法：该方法一般采用6mol/LHCl在真空条件下于110水解24-72小时，水解后除去过量的酸，大部分氨基酸可定量回收。 此法优点是：水解完全；不引起氨基酸发生旋光异构。 缺点是：色氨酸（TrP）和半胱氨酸（Cys）全部破坏，Asn 和Gln 转变成Asp 和Glu 。因而需用其他方法弥补其缺点。,碱解法：一般采用24mol/L NaoH 100水解48小时，优点是不破坏色氨酸，缺点是氨基酸可发生异构。,酶解法：由于酶的水解具有特异性，所以常用混合酶进行水解，常用的酶有外切酶，内切酶或链霉蛋白酶等。 优点是：条件温和；设备简单；不破坏氨基酸，不发生异构化。 缺点是：时间长，水解不易完全，中间产物多。,分析：,水解后所得的氨基酸混合物，可用电泳法，离子交换层析法和高压液相层析法分离鉴定，从而可知多肽链氨基酸种类和数目。 目前多采用氨基酸自动分析仪定量测定。仪器由分离和分析两大系统组成，分离系统应用聚苯乙烯阳离子交换树脂，通过离子交换柱层析使各种氨基酸得到分离，分析系统应用分光分析法测定。,3.肽链末端氨基酸的分析：,2，4二硝基氟苯在pH89的弱碱性条件下与肽链N-端氨基酸的-氨基结合，形成二硝基苯肽链，称为DNP-肽链。 然后用酸水解，肽链中的肽键全部断裂，生成游离氨基酸。由于二硝基氟苯与N-端氨基缩合形成的键十分稳定，不受酸解破坏，所以水解后生成DNP-氨基酸。 黄色的DNP-氨基酸可用乙醚抽提出来，用层析法鉴定即可知道N-末端是哪种氨基酸。,N-端氨基酸分析,二硝基氟苯法：（DNFB法）,DNFB法原理,丹磺酰氯法：,丹磺酰氯（DNS-Cl）在pH9.5的碱性条件下能专一性的与肽链N端的氨基结合生成氨磺酰衍生物DNS-肽。 经盐酸水解，得到DNS-氨基酸。 用乙酸乙酯提取后，用聚丙烯酰胺薄层层析可分离到DNS-氨基酸。 由于DNS-氨基酸在紫外线下产生强烈绿色荧光，故可用荧光分析法测出N-端氨基酸。,DNS-Cl法原理,异硫氰酸苯酯法：,在弱碱性条件下，异硫氰酸苯酯（PITC）与肽链N-端氨基结合后，形成苯氨基硫甲酰-肽（PTC-肽）。经弱酸水解。N-端氨基酸残基的肽键断裂，生成苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）。PTH-氨基酸可用乙酸乙酯提取出来，然后用层析法鉴定，即可确定N-端氨基酸。,C-端氨基酸的分析：,羧肽酶是一种外肽酶，它可专一性的切断C-端氨基酸的肽键，使C-端氨基酸游离下来，分离并鉴定游离氨基酸，即C-端氨基酸。常用的羧肽酶有A，B，C和Y四种，他们各具有特性： 羧肽酶A可水解芳香族氨基酸与侧链较大的脂肪族氨基酸所构成的C-端肽键； 羧肽酶B水解由碱性氨基酸构成的C-端肽键； 羧肽酶C专一切C-端脯氨酸的肽键； 羧肽酶Y能水解各种氨基酸在C-端的肽键，这是一种最适用的羧肽酶。,羧肽酶法：,肼解法：,将蛋白质和无水肼在100反应510小时后，除C-端氨基酸外，其它所有的氨基酸残基都转化为相应的酰肼化合物； 酰肼可与苯甲醛作用形成不溶性的二亚苄基衍生物而除去； 剩下的氨基酸就是C-端氨基酸，可用层析法鉴定出是哪一种氨基酸。,肼解法原理,4.肽链的分离：,靠非共价键结合的常用酸、碱、变性剂、去污剂等使其破坏。靠共价结合的，因比较牢固，需用特殊的化学的作用二硫键断裂法有过甲酸氧化法：二硫键与过甲酸反应生成磺酸，同时二硫键断裂;巯基还原法：二硫键在过量巯基乙醇，半胱氨酸，二巯基苏糖醇等存在下被还原为巯基而被打断。经过解析开来的单链，可应用各种层析或电泳法予以分离。,由二条以上肽链组成的蛋白质，肽链间的结合可能是靠非共价键结合，也可能是靠共价键结合，进行肽链顺序分析时，首先要将它们分离开来。,5.肽链的部分水解及肽段分离：,蛋白酶水解法：水解肽段常用的蛋白酶有胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶等。它们各有其专一性，例如：胰蛋白酶能专一性水解由精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）的羧基构成的肽键，生成的肽段C末端为Arg和Lys。 胰凝乳蛋白酶主要水解芳香族氨基酸（Phe.Tyr）羧基形成的肽键，生成的肽段C末端是Phe和Tyr。,分离得到单链后，一般由于太长，需水解成适当大小的肽段后再作顺序分析。水解肽段的方法有酶水解法和化学水解法两大类。,化学水解法：最常采用的是盐酸水解法，但因专一性差，同时产物不易分离，现已很少采用。目前最常用的方法是溴化氰水解法。溴化氰能专一性水解蛋氨酸（Met）羧基形成的肽键。,通过以上酶解法和化学水解法，可以使长的肽链断裂成小的肽段，水解后的肽段混合物可用凝胶过滤，离子交换层析，薄层层析及电泳等方法将其分离开来。,6.肽段氨基酸序列测定：,常用Edman降解法，其基本原理是将肽段与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，使PITC先与肽段的N-端氨基结合，并在酸性条件下环化断裂，生成稳定的PITC衍生物，称为PTH-氨基酸。 用层析法鉴定出N端氨基酸。 剩余的肽段再作第二轮循环分析，用于鉴定末端的第二个氨基酸。 如此反复循环可确定出肽链氨基酸顺序。 现已将Edman降解程序引入自动系统，称为顺序分析仪。,7.肽链氨基酸序列的确定：,将每个小肽段的氨基酸序列测出后，可用肽链重叠法确定出整条肽链的氨基酸顺序。现用一个16肽为例，通过测定推测出氨基酸顺序 。,（2）分别用胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶水解后，所得肽段经Edman降解法测出氨基酸顺序。 用胰凝乳蛋白酶水解得4个肽段其各自顺序是：C-1:Thr-Arg-PheC-2:Asn-Gly-Ser-TyrC-3:Asp-Gln-AspC-4:Gly-Ala-lys-leu-Ala-Tyr,（1）末端分析：N-端：Asn C-端：Asp,用胰蛋白酶水解得3个肽段，其各自顺序为：T-1:Asn-Gly-Ser-Tyr-Thr-ArgT-2:Leu-Ala-Tyr-Asp-Gln-AspT-3:Phe-Gly-Ala-Lys,(3)确定全部肽链序列：综合以上两种酶水解肽段顺序，找出关键重叠序列，从而推出此多肽链的氨基酸序列：,c-2:Asn-Gly-Ser-TyrT-1:Asn-Gly-Ser-Tyr-Thr-ArgC-1: Thr-Arg-PheT-3: Phe-Gly-Ala-LysC-4: Gly-Ala-lys-leu-Ala- Tyr TyrT-2: Leu-Ala- Tyr Tyr -Asp-Gln-AspC-3: Asp-Gln-Asp aa序列：Asn-Gly-Ser-Tyr-Thr-Arg-Phe-Gly-Ala-Lys- Leu-Ala-Tyr-Asp-Gln-Asp,多肽链中氨基酸序列分析,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,蛋白质结构测定,蛋白质三维结构测定方法及数量,蛋白质三维结构测定年增长图,第一节：X-射线衍射技术用于蛋白质晶体结构测定,原理基本过程优缺点应用实例,一、相关原理,光的衍射现象X射线的发现及应用本质的争论X射线衍射的发现晶体学基础知识X射线晶体衍射,?,光线拐弯了！,1.光的衍射现象,衍射现象：光波偏离直线传播而出现光强不均匀 分布的现象,当缝的大小（或障碍物的大小）跟波长相差不多时就发生明显的衍射现象如果缝很宽，其宽度远大于波长，则波通过缝后基本上是沿直线传播的，衍射现象就很不明显了,惠更斯菲涅耳原理,菲涅耳补充：从同一波阵面上各点发出的子波是相干波。 1818年,惠更斯：光波阵面上每一点都可以看作新的子波源，以后任意时刻，这些子波的包迹就是该时刻的波阵面。 1690年,解释不了光强分布！,2. X射线的发现历程及应用,失之交臂1836 法拉第 发现阴极射线1861 克鲁克斯 阴极射线管在放电时会产生亮光 干版和光片有问题？1890 古德斯柏德 洗出了一张X射线的透视底片 照片的冲洗药水或冲洗技术 发现X射线本质的争论X射线衍射,2.X射线的发现及应用,1895年 伦琴（Roentgen）发现故称为伦琴射线。,伦琴夫人的手的X射线照片,X射线在医学上的应用,伦琴的新发现轰动了全世界, 不到三个月, 维也纳的一家医院便拍出了应用于医疗的X射线照片.从此, X射线拍片和射线透视成为医学诊疗中常用的手段。为了防止各脏器成像发生的重叠给诊疗带来不便, 科学家们进一步研究了成像更清晰、灵敏度更高的仪器。1972年，英国科学家汉斯菲尔德运用计算机和图像重建理论, 制成了电子计算机射线断层扫描成像装置, 也就是已被广泛应用的CT。,X射线与诺贝尔奖物理学奖,伦琴因发现X射线而获得第一届诺贝尔物理学奖。1903 年诺贝尔物理学奖。1906 年的诺贝尔物理学奖。劳厄获得了1914 年诺贝尔物理学奖。英国的布拉格父子1915 年的诺贝尔物理学奖。英国的巴克拉1917 年的诺贝尔物理学奖。瑞典物理学家西格班1924 年诺贝尔物理学奖。美国的康普顿1927 年诺贝尔物理学奖。前苏联的切连科夫1958 年诺贝尔物理学奖;美国的霍夫斯塔特1961 年诺贝尔物理学奖;瑞典的西格巴恩1981 年的诺贝尔物理学奖。,化学奖,荷兰的物理化学家德拜1936 年诺贝尔化学奖。美国著名化学家鲍林1954 年诺贝尔化学奖。英国生物学家肯德鲁与佩鲁茨1962 年诺贝尔化学奖。英国女化学家霍奇金1964 年诺贝尔化学奖。美国化学家利普斯科姆1976 年诺贝尔化学奖。英国化学家桑格和美国化学家吉尔伯特1980 年诺贝尔化学奖。英国生物化学家克卢格因1982 年诺贝尔化学奖; 美国化学家豪普特曼和卡尔1985 年诺贝尔化学奖;1988 年,米歇尔等三位德国生物化学家诺贝尔化学奖。,3.X射线本质的争论,X射线本质的争论-波动说,巴克拉： X射线波动性 标识谱线：不管元素已化合成什么化合物，它们总是发射一种硬度的X射线，当原子量增大时，标识X射线的穿透本领会随着增大。这说明X射线具有标识特定元素的特性。,X射线本质的争论微粒说,X射线微粒论者 粒子具有旋转性,布拉克父子,4.X射线衍射,X射线衍射的获得,波长范围：100.1埃欲观察其衍射现象则衍射线度应与其波长差不多，晶体的晶格常数恰是这样的线度衍射波的两个基本特征衍射线（束）在空间分布的方位（衍射方向）和强度与晶体内原子分布规律（晶体结构）密切相关。,X射线晶体结构分析？ 使用X射线作为物理工具，依赖X射线衍射现象为物理原理，以晶体作为研究对象，晶体结构作为研究结果的一种分析方法。,5.X射线的获得：,X射线管,激光等离子体,同步辐射,X射线激光,6.晶体基础,什么是晶体晶体的周期排布晶体的对称性,3.1什么是晶体,固体物质晶体相当罕见的东西？非晶体晶体(Crystal )指离子、原子或分子这些微粒在三维空间中周期性重复排列形成的、能够给出明锐衍射的固体结构。,晶体什么样（1）,晶体什么样（2）,晶体什么样（3）,晶体什么样（4）,2.晶体和点阵结构,晶体的周期性结构使得我们可以把它抽象成“点阵”来研究. 一维周期性结构与直线点阵二维周期性结构与平面点阵三维周期性结构与空间点阵,一维周期性结构与直线点阵,二维周期性结构与平面点阵,三维周期性结构与空间点阵,晶胞(Unit cell)空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。同一个空间点阵，划分平行六面体的方式是多种多样的。选择平行六面体的原则：所选平行六面体的对称性应符合整个空间点阵的对称性。 选择棱与棱之间直角关系为最多的平行六面体 所选平行六面体之体积应最小。 当对称性规定棱间的交角不能为直角关系时，应选择结点间距小的行列作为平行六面体的棱，且棱间的交角接近于直角的平行六面体。,单位平行六面体，a、b、c 、 是表征它本身形状、大小的一组参数，称为格子参数或点阵参数。,单位平行六面体与坐标轴的关系：棱交角坐标轴之间交角。 a、b、c 轴单位。a、b、c、 关系有七种情况，与单位平行六面体七种格子相对应。,立方格子 a=b=c = =90o,三方格子 a=b=c = 90o， 60， 109o2816 ,菱面体格子中为特殊角度时，演变成的三种立方体格子,四方格子 a=b c = =90o,六方格子 a=bc =90o =120o,正交格子 a b c = =90o,单斜格子 a b c = =90o 90o,三斜格子 a b c 90o,按结点位置，可有四种不同的类型：,P 原始格子（角顶）,C 底心格子（角顶、顶底面）,I 体心格子（角顶、体心）,F 面心格子（角顶、每个面）,P 原始格子（角顶）,C 底心格子（角顶、顶底面）,I 体心格子（角顶、体心）,F 面心格子（角顶、每个面）,结构中代表各类等同点的结点在空间的排列方式来说，格子的种类有、且只有十四种。,衍射方向,二、X射线晶体结构测定基本过程,蛋白质获取（提纯）晶体生长并经冷冻技术处理重原子衍生物制备衍射数据收集衍生数据分析和改进结构模型的获取（包括修正）,（2）晶体生长过程及影响因素,晶核（尽量少）微晶（可用作晶种）晶体在数小时至数月后出现2个问题：是盐晶吗？能给出有用的衍射吗？（多晶/双晶）,影响因素物理因素：温度、压力、震动、溶剂清洁度、试剂纯度、重力、外加物理场等生物化学因素：pH、离子强度、沉淀剂/添加剂的类型和浓度等其他：溶液过饱和度、纯度等“经验” “机器人”,（2）晶体生长过程及影响因素,（3）结晶方法,批量结晶法 batch crystallization透射法 crystallization by dialysis液相扩散法 liquid diffusion气相扩散法vapor diffusion氢氘交换质谱技术Enhanced amidehydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry, DXMS生物玻璃bioglass,（4）晶体的初步鉴定,（5）衍射数据收集,晶体的处理：低温液氮气冷流技术数据收集仪：底片、面探测器,衍射分析仪器的发展,射线种类：连续射线 特征射线 电子衍射 中子衍射,探测技术：胶片 闪烁体计数器（点） （IP）CCD探测器（面）,图2-22 石英的衍射仪计数器记录图（部分）*右上角为石英的德拜图，衍射峰上方为（hkl）值，代表K衍射,底片（外森堡相机、徘循相机）,优点：多点同时收集容易保存价格便宜缺点存在“化学雾”背景和X射线散射背景费时、费力,计数管（四圆衍射仪）,将X射线光子强度转换为电信号，信号放大后再转换成数字存入计算机随时调用逐点收集数据优缺点与底片相反,面探技术-SMART APEX-CCD衍射仪,Smart CCD Overview,SMART APEX-CCD探测器,金属丝构成的面板，可同时多点收集将X射线光子强度转换为电信号集计数管的精确和底片的多点收集效率,面探技术-SMART APEX-CCD衍射仪,图像板image plate,面探测器的改进由化学材料构成，整块板子密度一致高分辨率可见光下可测量集底片和面探测器的优点于一身,（6）数据分析,电子密度修饰电子密度图诠释结构模型精化数据处理软件：Denzo, Scalepack,三、X射线晶体结构测定优点,分辨率高不损伤样品无污染相对快捷能得到晶体完整性的大量信息,晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；（瓶颈）X射线晶体衍射的工作流程较长。,四、X射线晶体结构测定存在问题,Last update: Tuesday Oct 20, 2009 at 5 PM PDT,于1971年和1972年分别得到分辨率为2.5埃和1.8埃的猪胰岛素晶体测定，这是中国阐明的第一个蛋白质的三维结构。,猪胰岛素(蛋白质编号4ins)的两条小链,“中国蛋白质晶体学研究水平和世界发达国家一样高！胰岛素晶体最好的电子密度图在北京，不在牛津。” 多萝西霍奇金 ，1972,五、应用实例1.胰岛素,2.菠菜捕光蛋白LHC II（膜、疏水，2.72）Nature, 2004, Mar.,LHC-II是绿色植物中含量最丰富的主要捕光复合物，这种复杂的分子体系镶嵌在生物膜中，具有很强的疏水性，难以分离和结晶。对其晶体结构的测定是国际公认的高难课题，也是一个国家结构生物学研究水平的重要标志。03年利用北京同步辐射实验室生物大分子晶体学线站获得了该晶体的高分辨率衍射数据，最终获得2.72分辨率的晶体结构。,发表于Nature2004年3月18日作为封面文章,Chang et al., Nature 428, 287 (2004),意义：发现了膜蛋白结晶的第三种类型，提供了近3万个独立、精确的原子坐标,复习思考题,简述X射线晶体结构测定的基本过程。了解晶体鉴定的基本要点。熟悉X射线晶体结构测定的优缺点。,第三章,蛋白质工程技术,Protein engineering,蛋白质工程的崛起,第一节,一、蛋白质工程崛起的缘由,通过基因工程能够大规模生产生物体内微量存在的活性物质，并借助转基因而改变动植物性状，得以在人类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。然而在广泛利用自然界各种蛋白质的过程中就发现，这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对它们进行产业化开发往往不合意，需要加以改造。1983年Ulmer首先提出蛋白质工程，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此以后，蛋白质工程迅速发展，已成为生物工程的重要组成部分。,基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。,基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。,蛋白质工程就是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋白质。,满足人类生产和生活的需要,玉米中赖氨酸含量比较低,天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）,天冬氨酸激酶（异亮氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）,玉米中赖氨酸含量可提高数倍,例如胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。,1、基因工程的应用（1）基因工程的实质：将一种生物的 转移到另一种生物体内，使后者产生本不能产生的 ，进而表现出新的 。（2）基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存在的 。2、天然蛋白质的不足 天然蛋白质是生物在长期 过程中形成的，它们的 符合特定物种 的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。3、蛋白质工程的目的 生产符合人类生产和生活的需要的 。,蛋白质工程崛起的缘由,基因,蛋白质,性状,蛋白质,进化,结构和功能,生存,蛋白质,二、蛋白质工程的基本原理,1.目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。,蛋白质的功能是DNA决定的，那么要制造出新的蛋白质，就要改造DNA，所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。,中心法则：,天然的蛋白质合成过程按照中心法则进行：,基因,表达（转录和翻译）,形成氨基酸序列的多肽链,形成具有高级结构的蛋白质,行使生物功能,2.原理：中心法则的逆推,3.基本途径：,从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构,推测应有的氨基酸序列,找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）,蛋白质工程的基本原理,基因DNA,氨基酸序列多肽链,蛋白质三维结构,预期功能,生物功能,mRNA,转录,翻译,折叠,DNA合成,分子设计,蛋白质工程流程图,基因DNA,氨基酸序列多肽链,蛋白质三维结构,预期蛋白质功能,蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;,（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,蛋白质结构测定一级结构测定：直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。三级结构测定：X-射线晶体衍射研究处在晶体状态下的蛋白质的空间结构核磁共振(NMR)光谱研究处在溶液状态的蛋白质的结构。,X-射线衍射技术： 用于蛋白质及核酸三维结构的确定，至今已有数百种蛋白质的结构被确定。,蛋白质工程的主要手段 以重组DNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。 位点特异性突变基于结构生物学、信息生物学基因突变 随机突变基于高通量筛选法 基因内部的剪接基因剪接 5或3端的剪接,基因定点诱变技术的常用方法是PCR法。,突变点：,人工合成的引物上,手段：,PCR技术,目的：,获得定点突变的基因,位点特异性突变：通过特异地改变编码核苷酸；而替代蛋白质中的某个氨基酸。可高效、准确地得到蛋白质突变体。但这种方法得到的突变体数量有限，因此在操作技术的带动下，发现了随机突变法。,高通量筛选法：从巨大数目的突变体库中筛选到具有期望功能的突变体。 基因剪接：在酶分子的编码基因上剪去或接上一段核苷酸。,蛋白质工程的基本原理,1、目标：根据人们对 功能的特定需求，对蛋白质的 进行分子设计。2、原理：改造基因（基因 或基因 ） 。3、流程： 预期蛋白质功能设计 推测应有的 序列找到对应的 序列。,蛋白质,结构,修饰,合成,预期的蛋白质,氨基酸,脱氧核苷酸,蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;,（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,蛋白质工程的概念,蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。,蛋白质工程的实质是对编码蛋白质的基因进行改造,三、蛋白质工程的基本原理,基因DNA,氨基酸序列多肽链,蛋白质三维结构,预期功能,生物功能,mRNA,转录,翻译,折叠,DNA合成,分子设计,中心法则,蛋白质工程,目的基因,预期的蛋白质功能,基因表达载体,基因,获取目的基因构建表达载体导入受体细胞目的基因的检测与表达,预期蛋白质功能设计蛋白质结构推测氨基酸序列推测核苷酸序列合成DNA 表达出蛋白质,定向改造生物的遗传特性，获得人类所需的生物类型或生物产品,定向改造或生产人类所需的