酵母细胞固定化实验的深度解析

酵母细胞固定化实验的深度解析 生物学是一门以实验为基础的自然科学，观察和实验是生物科学教学的重要方法，是实施素质教育的良好切入点。实验教学已成为高中生物教学内容中最重要的组成部分之一，同时也成为高考的重点和热点，现行高考不仅考书本实验，还考书外实验，不仅考实验的掌握应用，还考实验的迁移。下面对酵母细胞固定化实验的相关内容作一个深度解析。1 酵母细胞固定化原理的深度解析海藻酸钠是由a-L-甘露糖醛酸(M单元)与b-D-古罗糖醛酸(G单元)依靠1,4-糖苷键连接形成的丝性共聚物，其分子为(C6H7NaO6Na)n，不同海澡酸钠的M和G的比率和排列顺序不同，其分子结构如图1所示。由海藻酸钠的结构式可知，海藻酸钠含有很多游离的羧基和羟基，性质活泼，这些基团能与大多数二价或多价金属离子发生交联反应形成不溶于水的褐藻酸金属盐，如海澡酸钠与Ca2+形成海藻酸钙的胶体。图2是海藻酸钠和褐藻酸钙凝胶的红外光谱图，图中3 3703 420 cm-1归属为褐藻酸盐中OH伸缩振动峰，2 930 cm-1归属为CH基团的伸缩振动峰，15401650 cm-1是褐藻酸羧基的反对称伸缩振动峰，1 4881 350 cm-1，是羧基的对称伸缩振动峰，1 0001 100 cm-1是吡喃糖环CO伸缩振动峰。由图可以看出，褐藻酸钠在成凝胶前后发生的最明显的变化就是OH峰的位置，成凝胶前OH峰的波数为3 395 cm-1而成凝胶后为3 418 cm-1，成凝胶后向高波数方向偏移了23 cm-1，这些变化主要是因为褐藻酸钠成凝胶后GG段与Ca2+形成了配位结构，两个羧基氧、一个环间氧和一个羟基氧参与了配位，由于羟基氧参与了配位降低了氢键缔合程度使得OH峰向高波数偏移。另外在2 930 cm-1处褐藻酸钠在成凝胶之前CH伸缩振动吸收较强而成凝胶后C-H伸缩振动吸收较弱，其原因在于褐藻酸钠成凝胶后Ca2+与GG交联形成的网格状结构限制了六元环上CH键的伸缩振动，使得偶极矩变化较小，而吸收峰较弱。此外，1 5401 650 cm-1和1 4881 350 cm-1吸收强度减弱，这主要是由于钙的交联形成了COOCaOCO基团结构。这充分表明褐藻酸钠中羧基与Ca2+形成了螯合结构，进而证明了海藻酸钙分子是由Ca2+离子的交联形成的网状大分子。将海藻酸钠加入含钙离子的介质中，钙离子将置换海藻酸钠大分子中的部分氢离子和钠离子而转化为海藻酸钙分子，反应式为Ca2+HAlg+NaAlgCa(Alg)2+H+Na+。故凝胶体中同时存在NaAlg、HAlg和Ca(Alg)2，这3种结构相互交错连接，由于各自的结合力不同，导致整个海藻酸钙凝胶大分子结构的空间连接力亦不均衡，产生了较大的空隙，故可容纳其它的分子或细胞（如酵母细胞）。Ca2+在整个体系中起主导作用，有助于把分子连接在一起，这种作用形成了三维结构，里斯把它称作“鸡蛋箱”结构。这些功能基团的变化为制备功能性海藻酸钙凝胶提供理论依据，也是固定化酵母细胞的深层原理。2 海藻酸钙凝胶形成因素的深度解析采用氯化钙体系制作的海藻酸钙凝胶，受氯化钙浓度、温度、海藻酸钠的浓度影响较大，其中海藻酸钠与氯化钙的浓度是关键。马萍老师在海藻酸钙凝胶微球的制备和pH依赖性溶胀一文中指出，当海藻酸钠的浓度小于1或氯化钙的浓度大于0.02 mol?L-1时均不能滴制成球，而海藻酸钠的浓度大于4或氯化钙浓度高于0.2 mol?L-1时，在凝胶的表面迅速形成致密的交联结构，阻碍了Ca2+向凝胶内部的扩散，使得内部不能形成完整的凝胶结构。当氯化钙溶液的温度为50 时，Ca2+和褐藻酸钠的交联程度最好。另外褐藻酸钠分子中M/G对海藻酸钙凝胶的性能有着重大的影响。3 实验操作注意点的深度解析（1） 海藻酸钠浓度低会导致包埋的酵母细胞少。海藻酸钠浓度低，导致海藻酸钙凝胶结构中的间隙偏大，从而有一部分酵母细胞从间隙中漏出，所以包埋的酵母细胞少。（2） 海藻酸钠浓度过高会导致凝胶珠不成圆形或椭圆形。海藻酸钠浓度过高时，在凝胶的表面迅速形成致密的交联结构，阻碍了Ca2+向凝胶内部的扩散，使得凝胶内部不能形成完整的网状结构，所以凝胶珠的形状并不是固定的圆形或椭圆形，而会随凝胶珠空间位置的变化而发生变化。（3） 凝胶珠需要在CaCl2中浸泡30 min。在凝胶珠的形成过程中，先是表面形成交联结构，然后Ca2+向凝胶内部扩散，逐层形交联成网状结构，Ca2+向凝胶内部扩散是一个渐近的过程，需要一段时间。（4） 检测拉伸强度是检测凝胶珠制作是否成功的方法之一。凝胶珠内部的网状结构确保凝胶珠具有较好的拉伸强度。将制作好的凝胶珠放在实验桌上用手挤压，若有一定弹性不容易破裂（或将凝胶珠在实验桌上用力摔打，凝胶珠很容易弹起），则说明凝胶珠的拉伸强度较好，表明制备的凝胶珠是成功的。（5） 用手挤压凝胶珠是否有液体流出是检测凝胶珠制作是否成功的方法之二。当海藻酸钠滴入氯化钙溶液中，液滴表面立即胶凝，然后Ca2+向凝胶内部扩散，胶凝内部逐层发生凝胶反应，凝胶珠收缩变小，凝胶中的液体被挤出而进入外部介质。如果挤压凝胶珠有液体流出，则说明凝胶内部并没有形成凝胶网