试谈肠道致病菌的检验与鉴定

肠道致病菌的检验与鉴定,第一节概述,一、食品中常见的肠道致病菌沙门氏菌志贺氏菌大肠艾希氏菌变形杆菌耶尔森菌,二、生物学特性,1、形态与染色均为革兰氏阴性杆菌，中等大小，无芽胞，多数具有周身鞭毛能运动，志贺氏菌属无鞭毛无动力。2、培养和生化反应（1）需氧或兼性厌氧，菌落中等大小，表面光滑，液体培养基混浊生长。（2）肠道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多能分解乳糖、葡萄糖产酸或产酸产气。（3）可还原硝酸盐为亚硝酸盐。,三、抗原类型,四、致病性,（一）、致病物质1、内毒素：能引起机体发热，白细胞减少，低血糖，血压降低，严重者休克。2、外毒素：对小肠粘膜细胞具有特殊毒害作用，引起腹泻。,（二）、所致病疾1、伤寒和副伤寒2、食物中毒3、细菌性痢疾,五、微生物检验的基本程序,检样处理增菌培养分离培养生化试验血清学鉴定报告,第二节、沙门氏菌检验,一、概况（一）沙门氏菌的命名根据所致疾病命名根据菌的发现地区命名以发现者的名字命名（二）沙门氏菌的抵抗力6030可杀死,（三）沙门氏菌的分类地位及定义,1、地位：是肠杆菌科中的细菌2、定义肠杆菌科中形态和培养特征，生化反应及抗原结构相似，被O1噬菌体裂解的一群革兰氏阴性杆菌。,二、生物学特性,（一）、形态与染色：革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。（二）、培养特性1、需氧或兼性厌氧，最适温度37，PH7.27.4。,(沙门氏菌（红色）侵入人体细胞,2、对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37，24h，能形成菌落中等大小，直径23mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。,（三）、生化特性1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金盏花醇3、多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（VP）（-），4、能还原硝酸盐为亚硝酸盐（+）5、在KCN培养基中生长（-），苯丙氨酸脱氨酸（-）,（四）、抗原结构主要两种：A、O抗原B、H抗原C、表面抗原（K抗原）D、菌毛抗原,2、O抗原（1）O抗原的表示方法共有58种，用字母O和阿拉伯数字标记：O1、O2、O3、O4如：伤寒杆菌：O9、O12,（2）沙门氏菌的分群及表示方法用大写字母及相关符号表示：A、B、C、D、E、O51O63、O65O67,（3）沙门氏菌中的主要菌群及其群特异性抗原A群-O2B群-O4C群-O6C1群-O7、C2群-O6O8、C3群-O8、C4群-O6O7O14D群-O9F群-O11E群-O3E2群-O3、O10族E3群-O3、O15E4群-O1、O3、O19,3、H抗原（鞭毛抗原）,耐热性差：6015或酒精处理可破坏沙门氏H抗原有两种：第1相：特异相，用英文小写字母表示a、b、czz1z55第2相：非特异相，用阿拉伯数字表示1、2、3其中也有用小写字母a、n、x等表示。,4、表面抗原：,沙门氏菌有三种：Vi、M、K抗原Vi抗原位于菌体的最表层，包围了O抗原，可阻碍O抗原的血清学凝集试验。破坏Vi抗原：6030，1005含有Vi抗原的沙门氏菌：伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌,三、沙门氏菌食物中毒,（一）、引起食物中毒最常见的沙门氏菌：鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌（二）、易引起沙门氏菌中毒的食品肉、蛋、乳类食品,行业关注：美国两种花生酱含沙门氏菌,(三)、中毒原因,1、食用病畜禽的肉制品食品2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染3、用不洁净水处理食品,（四）、临床病状（所致病菌）,1、肠热病：伤寒与副伤寒病，为慢性发热的菌血病。由伤寒与副伤寒菌引起，潜伏期720天2、急性肠胃类：主要症状：头痛、发热、恶心、呕吐、腹泻、出冷汗、及全身不适，病程23天3、败血病：高烧、寒战、厌食、局部发炎、由猪霍乱沙门氏菌等引起,四、微生物检验,（一）、基本步骤（程序）检样增菌（前增菌）分离培养生化试验初步鉴定血清学反应最后鉴定报告,1、前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的细菌恢复活力;2、选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，其它细菌受到抑制;3、选择性平板分离培养：分离出所需的细菌;4、生化试验：鉴定分离出来的细菌是否符合所检项目的细菌;5、血清学鉴定：进一步鉴定。,（二）、检验操作关键点,1、前增菌：使待检菌复壮前增菌：增菌液一般用BPW,36，1824h，长有杂菌。2、选择性增菌：抑制杂菌生长，提高检出率选择性增菌：增菌液用TTB421，1824h和SC36，1824h。,2、平板分离,选择性培养基：BS、XLD（或HE、显色培养基）BS：黑色金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些形成绿色的菌落，周围培养基不变。HE：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎黑色；有些为黄色，中心黑色或几乎全黑。XLD：粉红色，带或不带黑色中心，可呈大的带光泽的黑色中心，或全黑色菌落；有些菌落为黄色，带或不带黑色中心。,BS上的菌落,HE上的菌落,显色培养基上的菌落,XLD上的菌落,3、五项生化试验,H2S、靛基质、PH7.2尿素酶、KCN、赖氨酸脱羧酶,硫化氢（H2S）试验,挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于361培养2448h，观察结果。培养基底部呈黑色，为阳性，记+培养基底部无黑色，为阴性，记-,三糖铁培养的培养,典型沙门氏菌在三糖铁培养上的特征：表面（-）粉红色、底层（+）黄色、H2S（+）底层有黑色、有动力。在TSI培养基中：表面（+）黄色、H2S（-）的培养物可排除，其它培养物均有可能是沙门氏菌。,靛基质试验,靛基质+,尿素酶试验,阳性,赖氨酸脱羧酶试验,取待检菌，分别接种于含有赖氨酸的培养基内和不含赖氨酸的对照培养基内，在361培养14天，每天观察结果。试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记+试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记-。,氰化钾试验,取培养2024h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，361培养2448h，观察结果。对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记-。,（2）、典型沙门氏菌的五项生化反应及其检验的利用,A、典型五项生化反应：A1H2S（+）靛基质（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）赖氨酸脱羧酶（+）如尿素、KCN、赖氨酸脱羧酶有1项异常，按表判定,B、利用五项生化反应鉴定沙门氏菌的最简单方案,a、五项生化反应：A2H2S（+）靛基质（+）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）赖氨酸脱羧酶（+），补做甘露醇和山梨醇试验，均为阳性为沙门靛基质阳性变体，需结合血清鉴定结果。b、五项生化反应：A3H2S（-）靛基质（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）赖氨酸脱羧E（+/-），补做ONPE试验，ONPE（-）为沙门氏菌，ONPE（+）大肠艾希氏菌必要时进行沙门氏菌生化菌群鉴别,5、血清学试验（最后鉴定）,（1）、沙门氏菌诊断血清的种类：10种组合血清：主要用于伤寒和副伤寒沙门氏菌鉴定26种组合血清：常见致病菌的定群与分型57种组合血清：常见定型，初步鉴定AF群以外的菌型144种组合血清：全套装,（2）、血清学检验步骤,抗原准备AF多价血清检验（判定是否是沙门氏菌）群特异性抗体血清（如O2、O4、O3、O7、O8、O9、O10、O11（判定O群别）O单因子血清检查H因子血清检查（分型）报告,五、检验结果的报告,1、凡血清学鉴定与生化反应均符合者，报告检出沙门氏菌。经检验，报告25g（mL）XX食品中检出沙门氏菌2、凡血清学鉴定与生化反应均不符合者，报告XX食品中未检出沙门氏菌。,思考题：,1、典型沙门氏菌的五项生化试验结果如何？2、沙门氏菌的形态特征，培养特性是什么？3、沙门氏菌检验时为什么要进行前增菌和增菌？4、沙门氏菌有哪些抗原？各有何特点？O、H抗原如何表示，AF群沙门氏菌中，代表每群O特异性抗原的独特因子是什么？,5、沙门氏菌哪几个菌型具有Vi抗原，Vi抗原对O抗原血清涟试验有何影响，对含Vi抗原菌，如何做O抗原血清学试验。6、沙门氏菌在SS平板，TSI培养基上生长的现象如何，说明其原理。7、分离纯化后怎样选用最少的生化试验方法初步鉴定检验菌是否是沙门氏菌属的细菌。8、如何进行沙门氏菌的血清学试验。,第三节、志贺氏菌的检验,一、生物学特性（一）、形态与染色革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无鞭毛23um*0.50.7um,（二）、培养特性,1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37，PH7.27.42、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小的菌落3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。,（三）、生化反应,1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏菌外，均不发酵乳糖。2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。3、不产生H2S，不分解尿素，V-P试验阴性，不能利用柠檬酸盐。4、甲基红阳性。,（四）、抗原结构,1、抗原构成：O抗原：群特异性抗原：A、B、C、DK抗原：除B群外，一般有K抗原,2、志贺氏菌的分群与血清型,志贺氏菌分为四群：A群（痢疾志贺氏菌）：110型B群（福氏志贺氏菌）：16型+X、Y两个变种，C群（鲍氏志贺氏菌）：115型D群（宋内氏志贺氏菌）：1个型,志贺氏菌属抗原的分类,葡萄糖+,乳糖-,甘露醇-,痢疾志贺氏菌1、3、4、5、6、9、10型,痢疾志贺氏菌2、7、8型,福氏6型，鲍氏1、2、3、4、5、6、8、10、12、14型,福氏痢疾菌（1、2、3、4、5型）鲍氏5、7、9、11、13、15型,靛基质-,乳糖+,宋氏志贺氏菌,靛基质-,靛基质+,靛基质-,靛基质+,甘露醇+,3、属内外抗原关系,（1）群内抗原关系：A群：2与10型，具有密切关系C群：1与4和11型，10与11相关B群：群抗原是B群各型之间的共同抗原（2）群间抗原关系：C群17型与A群3型相关C群18型与A群11型相关,（3）属外抗原关系：志贺氏菌与埃希氏菌属的O抗原关系非常密切，除A群9型和D群宋氏菌与埃氏希菌的O抗原关系未见报道外，每一个型都与一定的埃希氏菌的O抗原有关。,4、K抗原对O抗原血清学试验的影响可阻碍O抗原的血清学凝集试验，煮沸处理即可。,（五）志贺氏菌的抵抗力,志贺氏菌属在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34天，37水中存活20天，在粪便内（室温）存活11天。日光直接照射30分钟，56-6010分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。,二、志贺氏菌的致病性与食物中毒,（一）流行病学,传染源,食物、病人、粪便、苍蝇等,（二）志贺氏菌的致病性,致病因素：侵袭力、菌体内毒素、外毒素,（二）临床症状,A、急性细菌性痢疾：急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢。B、慢性细菌性痢疾：慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型。,三、微生物检验,（一）检验步骤（程序）检样样品处理增菌培养HE或SS、麦康凯或EMB平板分离培养初步生化鉴定最后血清学鉴定报告,（二）检验操作要点,志贺氏菌在常温中生存的时间较短，应尽快进行试验。如24h内不能检验，样品应在冰箱内长时间不能检验，放在低温冰箱内。,1、增菌培养,培养基：GN增菌液在36168h，当培养液出现轻微混浊即中止培养。,2、分离培养,强选择性平板：SS或HE弱选择性平板：EMB或麦康凯在孵箱中361培养1824h，菌落特征：无色透明，中等大小，光滑圆形菌落。,HE平板原理及反应,发酵乳糖的某种肠杆菌,不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌,不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌,SS平板原理及反应SSAgar(SalmonellaShigellaAgar),大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌,是沙门氏菌。有黑色中心。如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了,麦康凯琼脂平板,EMB平板照片及原理,3、初步生化鉴定,从平板上挑取34个可疑菌落，接种于TSI和葡萄糖半固体培养基各一管，36，1824h，,三糖铁（TSI）琼脂试验的原理,2志贺氏菌3沙门氏菌4大肠杆菌,葡萄糖半固体原理及结果。,OrganismTestResult1.Pseudomonasaeruginosa（铜绿假单胞菌）：Motile2.Staphylococcusaureus：Non-motile3.Bacillussubtilis：Motile,志贺氏菌在TSI生长的结果（现象）：（1）斜面产碱仍为红色或粉红色；（2）底层产酸不产气，变黄色；（3）不产H2S，不出现黑色。志贺氏菌在半固体培养基生长：沿线生长，无动力。,在志贺氏菌检验中可弃去的培养物：,（1）在TSI表面上呈现蔓延生长的培养物（2）在1824h发酵乳糖、蔗糖的培养物（3）不分解葡萄糖，只在半固体培养基表面生长的培养物。（4）产气的培养物（5）有动力的培养物（6）产H2S的培养物,4、血清学试验和生化鉴定试验,（1）血清学分