单细胞培养PPT演示课件

Haberlandt：,观点：,首次进行离体细胞培养,高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞,小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞,1,单细胞培养,细胞悬浮培养,细胞培养,2,第5章单细胞培养及突变体筛选1细胞培养2单细胞的分离3单细胞的培养方法4突变体的筛选,3,1细胞培养1.1细胞培养：将植物体或其培养物游离的细胞或小细胞团进行培养的方法。培养方式单细胞培养悬浮细胞培养培养对象细胞个体细胞群体培养产物单细胞克隆系次生代谢产物酶制剂、人工种子等应用领域筛选突变体，食品、药品、工业原料、细胞学研究，农业生产进行遗传操作,4,1.2细胞培养的意义：,细胞悬浮培养,植株,人工种子,原生质体,有用次生代谢产物,突变体的筛选,5,2单细胞的分离,6,2.1由外植体直接分离物理法：叶片捣碎过滤、离心收集细胞酶解法：,注：必须对细胞进行渗透压的保护,7,2.2由愈伤组织获得,固体培养,液体培养,过筛,单细胞体系,外植体,获得愈伤组织，并多次继代,悬浮细胞,高盐分、高生长素,8,要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。适于悬浮培养适于再生植株,9,将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物,优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。,注：由愈伤组织分离单细胞的关键是获得均一、松散的适合悬浮培养的愈伤组织,10,11,2、单细胞培养方法：,2.1培养方法1）平板培养法2）看护培养法3）饲喂层培养法4）微室培养法2.2单细胞培养的影响因子1）细胞植板密度2）培养基的成分,12,2.1培养方法：1）平板法（platingculture）（薄层培养）1960年Bergamann首创，是在固体培养基中培养单细胞的一种方法。,13,14,I细胞密度：指单位体积内的细胞数量，是影响细胞培养的关键因子。平板培养要求保证细胞密度为104-105个/ml。II平板培养的效果用植板率来衡量。,细胞密度和植板率,植板率（plateefficiency）：能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。PE=平板中新形成的细胞团数/平板中接种的细胞数100,15,优点：单细胞在培养基中分布较均匀，便于定点观察，筛选效率高、量大，操作简便缺点：通气状况不佳，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。,16,2）看护培养,1954年，Muir首次创立此法是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法，这块愈伤组织被称为看护组织.愈伤组织不仅为细胞提供了营养，还提供了促进细胞分裂的某些物质,17,18,优点：简便、成功率高缺点：不能在显微镜下直接观察,19,3）饲养培养（feederlayerculture）：原理：平板法看护法评价：单细胞和原生质体培养的理想方法。注：饲养层细胞没有种属特异性。,20,4）微室培养（microchamberculture)人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称为微室培养法。此法首先是由Jones等（1960）设计,21,22,优点：可对细胞培养过程连续进行显微观察，了解一个细胞经过生长、分裂、分化，形成细胞团的全部过程。缺点：微室培养用的培养基量少，营养和水分就难以保持。pH值变动幅度大，培养的细胞仅能短期分裂。,23,2.2单细胞培养的影响因子,细胞密度,培养基成分,24,（1）细胞密度与培养基成分关系当细胞植板密度高时（104105个/mL）可使用和愈伤组织培养相同的常规培养基当细胞植板密度低时要求使用复杂培养基，常采用KM8P培养基或条件培养基，并结合使用看护培养、饲喂层培养等方法。,25,26,（2）细胞密度直接决定细胞分裂与否：细胞分裂要求细胞密度达到一定水平；细胞会产生某些物质，并分泌到培养基中，只有当这些物质在培养基中达到一定的临界水平，细胞分裂才启动。,27,生长因子,何种物质？,用量多少？,简化的纯合成培养基培养单细胞,28,3、应用筛选细胞突变体3.1突变体的特征自然界突变体发生频率低突变体继代多次都能稳定遗传突变体中具有相应变化了的基因产物或生理生化代谢上的差异突变体细胞形成的再生植株能通过有性传递保证其突变型,29,3.2获得突变体的方法自发突变（体细胞无性系变异）在组培过程中形成的再生植株表现出的遗传变异特点：自发产生，无外在的选择压力；对于筛选目的突变体有一定的盲目性适应材料：植物组培的培养物,30,诱发突变人为地采用物理和化学因素，诱发生物体产生遗传物质的突变，经分离、选择、培育成新品种的途径方法：物理诱变、化学诱变对象：种子、营养器官、离体培养材料（愈伤组织、单细胞、原生质体）,31,3.3细胞突变体筛选的优点与意义（与整体植物相比）培养细胞壁薄,缺乏角质层和蜡质层，且处在不断分裂中，比整体植物或种子更容易接受诱变；细胞水平诱变周期短，缩短育种年限；处理数目多，收率高；避免了整株水平上常出现的嵌合体；节省人力和物力进行选择，筛选效率高；,32,3.4细胞突变体筛选的技术路线：选择起始材料，获得愈伤组织，制备单细胞悬浮系人工诱变或自发突变单细胞突变体筛选有益突变体单细胞培养，获得克隆再分化再生植株突变株的鉴定栽培种苗表型：抗除草剂、抗盐碱、抗病、抗氨基酸等,33,（1）选择方法直接选择：将培养细胞置于一定选择压力之下的选择方法。选择抗性植株eg：耐盐、抗除草剂、抗病、抗氨基酸突变体等,34,间接选择：利用细胞内反应，形成某种有毒物质使野生型被淘汰，从而选出突变体eg：硝酸还原酶突变株在氯酸盐培养基上，具有硝酸还原酶活性的野生型细胞将被杀死，而突变株可以存活。,35,小麦耐盐细胞突变体筛选1.小麦穗（花粉发育到单核晚期）射线辐照诱变。2.取花药接种在N6+2,4-D2.0+KT0.5+NaCl0.3上诱导愈伤组织。3.在去盐培养基上，将上述愈伤组织继代13次。4.移愈伤组织至N6+NAA1.0+KT1.0+NaCl0.3上分化成苗。5.将再生植株移栽到盐渍土中，检测其耐盐性。对耐盐好的植株以秋水仙素处理，使染色体加倍。6.对入选株后代进行耐盐稳定性测定、遗传分析