22常见的细胞生物学检测技术PPT演示课件

第22届，常见细胞生物学检查技术，基本内容，一，细胞大小的测定二，细胞数的测定三，细胞重量的测定四，细胞活力的测定五，染色体核型与分带六，级总结七，操作，物镜测定微尺度-放置在舞台上的目镜测定微尺度-目镜细胞尺寸的测定，一，细胞尺寸的测定，一，细胞尺寸的测定，微尺度测定物镜测定微尺度(简称物微尺度或载物台微尺度)和目镜测定微尺度(简称眼微尺度)， 两者合作的眼睛微尺度是可以放入目镜的特殊玻璃晶片，在晶片中央刻有直线，该线被分成几个格子。 尺子封在载玻片中央的小尺寸，长度为1mm，等分为100格，长度为0.01mm(10m )。 另一方面，细胞大小的测定，在测定细胞大小时，不能用物质千分尺直接测定细胞，只能用眼睛千分尺。 由于用眼睛微尺测量的细胞是用物镜放大后的像，因此以该栅格为代表的实际长度根据物镜的放大率而变化，在测量时首先用物微尺测量，以某个放大率求出以眼睛微尺的栅格为代表的实际长度，然后在显微镜的载物台上放置物微标尺，小心地转动目镜的微标尺，移动物微标尺，使2尺平行，找到起点线重叠的地方，记录起点线和重叠线之间各标尺的刻度数(方格数)，用下式计算。 在该放大系统中，眼睛微尺度各块所代表的实际长度：眼睛微尺度的各块所代表的实际长度=物理微尺度的块数/眼睛微尺度数*10mm，例如眼睛微尺度为100块，与其对应的物理微尺度一、细胞大小的测定，二、细胞数的测定，二、细胞数的测定，(一)原理采取一定稀释的细胞或小孢子原生质体悬浮液，注入血球计数板的计数室，在显微镜下分段计数。 因为仪表板是特制的承载板。 在上面由4条平行槽构成的3个平行台，中央的台宽，该台的中央被短槽分割成两个，各边的台上分别刻有方格网，各眼网共计分成9个格子，中央的格子是该计数板的计数室。 计数室的边长是1毫米。 中间平台下沉0.1mm，盖上盖片，计数室的容积为0.1mm。 因此，可以从显微镜观察到的细胞数换算成每单位体积的细胞数。 二、细胞数的测定，(一)原理上常用的血球计数板的计数室有两个规格。 一个大方眼分成16个中方眼，一个中方眼又分成25个小方眼，另一个大方格分成25个方格，各方格还分成16个方格。 无论哪个规格，其计数室的小格子数总是相同，由400个小格子构成。 计数时，通常只计数5个中格的细胞数即可。 取样品：取悬浮细胞的小孢子或原生质体悬浊液，按一定比例稀释。 2、检查计数板：正式计数前，用显微镜检查计数板的计数室，检查有无杂质和干燥的菌体附着。 如果有污垢的话，(1)需要擦洗。 在药棉上涂上95%的酒精，轻轻擦拭计数板的计数室。 (2)清洗。 用蒸馏水清洗计数板，用绒毛纸吸收其上的水分(注意：不要用内炎晾干)，最后用擦拭纸擦拭。 (3)镜检。 镜检清洗后的计数板，只在计数室没有污垢的情况下，可以用于细胞的计数。 操作顺序，3，样品：首先把复盖波长板放在计数室上，摇动样品取出悬浊液，沿着复盖波长板和计数板之间的间隙侵入计数室，连续23次直到满足计数室的平台。 4、计数：将装有样品的计数板放在显微镜台的中央，按照以下顺序操作： (1)找到计数室。 首先，在低倍显微镜下，寻找计数板上的大格子的位置。寻找的时候请缩小显微镜的光圈，把视野变暗。 接着，沿着大格子线，移动计数板，使计数室位于视野的正中间。 (2)转动高倍镜。 转移到高倍镜后，适当调节光度，直到细胞和计数室的线清晰为止。 然后，把计数室一角的中格移动到视野中。 (3)计数。 通常，计数室内的细胞量用共计5个中格的细胞值表示。 把应该计数的中格中的细胞一个一个地计数。 为了避免计数时重复和忽略，分布在格子线上的菌体总是将与格子线接触的菌和与侧线接触的菌计入正式内，作为菌数。 减少人为的计数误差。 把测量的细胞数填写在表中。 (4)清洗。 计数结束后，计数板先用95%酒精轻轻擦拭，用蒸馏水清洗后晾干，最后用擦拭纸擦拭。 操作程序，三，细胞重量的测定，1，生重琼脂固体培养基生长的细胞材料，采用取出细胞材料，清洗琼脂培养基，用滤纸吸收水分，直接提取重量的方法。 液体悬浮培养材料，在已知重量的尼龙丝网上过滤，水洗除去培养基，吸滤除去附在细胞上的水滴，可以测量重量。 三、细胞重量的测定，二、干重慎重地取出固体培养基上生长的愈伤组织，放入计量瓶中，用60度烘箱烤1224小时。 在液体培养基中生长的浮游细胞，收集到用抽滤法预先测量过的超过滤器中，水洗后吸引干细胞表面的水，用60度烤箱烤1224小时。 干燥的材料放在分析天平上称重，减去尼龙网和超滤器的重量。 细胞材料干燥了。 四、细胞活力的测定，一、四唑(zuo)盐比色法(MTT )的测定原理：活性细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶将外源性黄色MTT还原为水不溶性蓝紫色结晶甲舍(za-)，在细胞中堆积，甲舍的生成量在通常情况下与活性细胞数成比例，死细胞具有此功能二甲基亚砜(DMSO )是溶解细胞中甲舍的蓝色溶液，用酶测定仪在490nm的波长下测定其光吸收值，在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成比例。 从测定的吸光度值(OD值)判断活细胞数，OD值越大细胞活性越强(测定药物毒性时表示药物毒性越小)。 1、四唑(ku)盐比色法(MTT )的优点：灵敏度高，方便的缺点： MTT还原产生的甲舍产物不溶于水，只有溶解后才被检测。 这不仅增加工作量，还影响实验结果的正确性。 MTT法只能检测细胞相对数和相对活力，而不能测定细胞绝对数。 MTT一般现在使用比较好，要避开过滤除菌、光保存，为了致癌，实验时要戴手套，要小心。 四、细胞活力的测定，一、四唑盐比色法(MTT )的应用：广泛用于几种生物活性因子的活性检测、大规模抗肿瘤药的筛选、细胞毒性试验和肿瘤放射敏感性测定等。 四、细胞活力测定2、胸腺嘧啶核苷(3H-TdR )渗透法胸腺嘧啶核苷(TdR )是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必要物质。 曾配合DNA作为同位素3H标记TdR的3H-TdR作为DNA合成的前体，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢和细胞增殖状况。 缺点：有放射性。 四、细胞活力的测定，三、三苯四唑氯化(TTC )法三苯四唑氯化(TTC )是标准氧化电位80mV的氧化还原色素，溶于水成为无色溶液，还原后生成红色不溶于水的三苯腙(TTCH或TTF ) 组织中脱氢酶活性的强弱与其活力呈正相关。四、细胞活力测定，无胚死胚正常，五，染色体的核型和分带，五，染色体的核型和分带，原核生物和真核生物的根本差异在于原核生物只有一个染色体，大部分真核生物的大部分体细胞具有二倍体数的染色体，即通常是两组染色体。 中间核使用光镜是看不见染色体的。 在有丝分裂中期染色体被染色后，其形态和数量可以用光镜的酒捏很好地观察。 中期染色体各有两个姐妹染色体，它们处于高度凝聚的状态。 大多数细胞遗传学分析依赖于中期染色体。 五、染色体核型和分带，正常男性核型，1 .核型：细胞分裂中期染色体特征的总和。 包括染色体的数量、大小、形态特征等。 2 .带状：染色体经物理、化学因素处理后，进行分化染色，使染色体出现明显稳定的染色体带状。 每个染色体号码都有不同的带状。 分带技术由于染色和预处理方式不同，有g带、c带、q带、n带、r带等不同的技术。 五、染色体的核型和分带、g带技术是其中最常用的技术。 方法对未染色中期染色体片进行加热或蛋白水解酶处理，然后再用吉姆萨染料染色，结果染色体呈现清晰特异的g带。 g波段反映了染色体DNA上A-T丰富的地区，人类能鉴定约2000条g波段。 g波段不仅稳定，用扫描电子显微镜也能看到波段收缩的痕迹。 目前正在制作人类的g波段标准图像。 可以用于确定染色体编号的数量和基因的位置。 植物中g带的技术不成熟，很多植物很难显示g带，结果不稳定。 五、染色体核型与分带、g带、c带技术与g带技术同时建立，主要显示染色体中构成型的异染区，如着丝带。 常用于植物的染色体分类。 q-band技术用艾卡奎林对中期染色体进行染色，在与染色体的g-band相同的区域产生另一个荧光带，在荧光显微镜下能看清，能用于诊断，但