SNT 2847-2011 水貂阿留申病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜水貂阿留申病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犪犾犲狌狋犻犪狀犱犻狊犲犪狊犲狅犳犿犻狀犽发布实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前言本标准按照给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：王伟利、孟庆峰、柏亚铎、肖成蕊、孟日增、石建平、姜焱、宋战昀、闫喜军、刘和平、罗雁非、王振国。犛犖犜水貂阿留申病检疫技术规范范围本标准规定了水貂阿留申病的检疫技术规范，包括病原分离鉴定、对流免疫电泳、及荧光等鉴别诊断技术。本标准适用于进出境水貂的阿留申病检疫、疫情监测和流行病学调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法临床诊断概况水貂阿留申病（，）又称浆细胞增多症，是一种由主要侵害水貂免疫细胞的阿留申病毒（，）引起的，导致自身免疫系统紊乱并逐渐衰竭，同时并发强烈的自身免疫的慢性传染性疾病。发病症状病貂精神沉郁，嗜睡，渴欲猛增，常在水槽中暴饮，食欲时好时坏；贫血，抓捕时齿龈易出血，可视黏膜苍白，口腔黏膜、齿龈和软腭上出现出血和溃疡；排煤焦样便，多死于尿毒症，进行性消瘦，生长缓慢，营养不良，体重减轻。病程数周、数月不等。个别貂具有神经症状，表现抽搐、痉挛、步态蹒跚，共济失调或后肢麻痹等症状。病理变化血液变化主要表现在浆细胞增多和血清丙种球蛋白量增加。丙种球蛋白可从正常貂的血清，增至。病理剖检变化死貂尸体高度消瘦，多数病例有腹水，表现肝变性或不同程度的肿胀，质地增厚、淤血、呈红褐色，实质内有小坏死灶；肾肿大，充血，表面散在斑点状出血，高低不平，肾小球的基膜模糊不清，出现萎缩；脾和淋巴结显著肿大，呈暗红色；心脏扩张；肺气肿、有出血点；脑膜充血。流行病学病貂和隐性感染水貂是本病的传染源，病毒通过粪便、唾液、尿液等途径排除和扩散，通过消化道、呼吸道感染，也可通过胎盘直接传染给后代。本病常年流行，没有年龄、性别的明显区别，成年水貂感染率高于育成水貂，新生仔兽感染率较低，随着月龄逐日增加，该病对母貂危害更大，病貂几乎均以死亡告终。秋、冬交际变冷的季节，感染水貂的发病率和死亡率明显高于其他季节。由于本病在临床上主要是经过缓慢，呈隐性感染较多，临床症状不典型，且易与其他疾病相混淆，根据本病在流行病学、症状和病理变化只能作出初步诊断。进一步确诊须通过实验室检查。犛犖犜病原分离鉴定仪器、试剂与材料仪器生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、高速冷冻离心机、组织匀浆器。移液器移液器（、）、吸管（、）细胞培养瓶。材料与试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合分析实验室用水规格。培养液、维持液、胰蛋白酶溶液（配制方法见）、新生犊牛血清、青霉素、链霉素。细胞猫肾传代细胞（）。病料采集与处理组织脏器的采集与处理无菌取病貂的肝、肾、脾、肠细膜淋巴结等组织脏器各，按的比例用不含犊牛血清的培养液制成匀浆，反复冻融三次，离心，取上清液经微孔滤膜过滤，加入抗菌素至终浓度为青霉素，链霉素，冷藏备用。粪便、尿、血清及全血样品采集与处理取粪便，按的比例用不含犊牛血清的培养液制成悬液，然后，离心，取上清液经微孔滤膜过滤，加入抗菌素至终浓度为青霉素，链霉素，冷藏备用。取尿液样品，离心，取上清液经微孔滤膜过滤，加入抗菌素至终浓度为青霉素，链霉素，冷藏备用。无菌采取发病动物全血，加入柠檬酸钠抗凝剂，冷藏备用。无菌采取全血并分离血清，加入抗菌素至终浓度为青霉素，链霉素，冷藏备用。病料接种当经过培养液培养的细胞长成单层时，弃去培养液，用培养液冲洗细胞单层，然后将上述处理过的样品接种已经长成单层的细胞，接种量为培养液量的，恒温培养箱中吸附，倾去多余液体并用无血清培养液冲洗一次，加入含新生犊牛血清（经过水浴灭活，过滤除菌，无支原体）的培养液，置的二氧化碳恒温培养箱中培养，在此期间采用维持液。同时设正常细胞对照。观察结果接种后置显微镜下观察。如果正常细胞对照成立，接种病料的细胞出现细胞变圆、拉网、脱落等细胞病变，收获细胞培养物，放入冰箱中待鉴定。如果对照细胞与接种样品细胞均无变化，应盲传代，必要时可增加传代次数。如果盲传过程中出现细胞病变，按上述原则，收获细胞培养物，放入冰箱中待鉴定；若盲传代未出现细胞病变，则按未分离到水貂阿留申病毒出具结果。犛犖犜病毒鉴定取细胞培养物进行负染，电镜下观察，病毒粒子为，呈球形，正二十面体结构。或将细胞培养物进行或荧光进行鉴定。对流免疫电泳仪器、材料与试剂仪器电泳仪、电泳槽。材料玻璃板（厚，或），直径打孔器，移液器（、），吸管（、）。试剂三羟甲基氨基甲烷（）巴比妥钠缓冲液（见）、琼脂糖。抗原由指定单位提供或将阿留申病毒国际标准毒株通过传代细胞培养，其培养物经过灭活制备而成。血清阴性血清由指定单位提供或采集非感染阿留申病的健康水貂血液分离获得血清。阳性血清由指定单位提供或用阿留申病毒国际标准毒株的细胞培养物免疫家兔后分离血清制成，或采自已知阿留申病阳性貂血分离而成。被检血清用塑料毛细管在貂趾尖采血，将管两端烧融封口或者橡皮泥封口，放在环境下静置，再放冰箱，吸出血清加入离心管中，离心，取上清液备用。电泳板的制备取水平无划痕的玻璃板将其清洗干净后平放在试验台上，用吸管吸取已融化并冷却至左右的琼脂糖缓冲液，利用张力将缓冲液均匀地铺于玻璃板上，待冷却凝固后备用，现用现配。打孔及封底将已凝固的琼脂糖凝胶板放在孔径、孔距的打孔模型图纸上，用打孔器进行打孔，然后用针头将孔内的胶轻轻地挑出。参见附录。待打孔完毕，将玻璃板置酒精灯外焰上加热，使各孔底部与玻璃板凝固形成封膜，置室温冷却，备用。犛犖犜加样待检血清按编号顺序用移液器逐份加到靠阳极的血清孔内，以加满不溢出为宜，每份样品更换一个移液器的吸头；将抗原用移液器加在对应的靠阴极的抗原孔内，以加满不溢出为宜。同时每板设阳性和阴性血清对照。电泳将电泳槽两侧加满电泳缓冲液，将加样完毕的平板放于电泳槽架上，将抗原孔端置于电泳仪阴极，血清孔端置于阳极，以双层滤纸或纱布进行搭桥，一端放在琼脂糖板的边缘，不要盖住加样孔，一端放入电泳槽内的电泳缓冲液中。接通电源，电压为，结束电泳观察结果。结果判定判定条件电泳结束后，关闭电源，取出玻璃板在阳光下或白灯下以黑色为背景观察沉淀线，判定结果。只有标准阳性血清和抗原孔之间有明显沉淀线，标准阴性血清和抗原孔之间无沉淀线时，判定结果有效，否则无效。若在抗原和血清孔之间出现模糊不清的沉淀线而难以判定时，可用氯化钠水溶液浸泡琼脂板，或放冰箱湿盒内次日判定。若次日仍无法判定则应重做。阳性判定在抗原和血清孔之间稍偏向血清孔一侧形成一条直的或弯曲的十分清晰的灰白色沉淀线即判为阳性。阴性判定在抗原和血清孔之间无任何沉淀线，或虽在血清孔近旁出现较宽呈云雾状的弧形沉淀带，但其外侧缺乏另一条直的灰白色沉淀线者，判为阴性。聚合酶链（犘犆犚）反应设备、材料与试剂设备扩增仪、低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析系统、冰箱、生物安全柜、组织匀浆器。材料可调微量移液器（、），、离心管和吸头（用水处理后高压灭菌备用，处理方法见）。试剂所用水均符合分析实验室用水规格。蛋白酶、饱和酚、酚三氯甲烷异戊醇（）、无水乙醇、乙醇、（）、（）、犜犪狇聚合酶（）、（每种浓度均为）、（）、氯化镁（）、琼脂糖（电泳级）、冰乙酸（）电泳缓冲液、溴化乙锭溶液、琼脂糖凝胶（配制方法见附录）。阳性对照由指定单位提供或将阿留申病毒国际标准毒株通过传代细胞培养，其培养物经过犛犖犜灭活制备而成。阴性对照由指定单位提供或将生长良好的猫肾传代细胞，冻融次次，离心，取上清液备用。引物根据水貂阿留申病毒（）国际标准株基因序列，在其保守的基因序列内设计合成一对特异性引物：，配制成。保存。犇犖犃的提取取中处理样品，或取病毒细胞培养液，反复冻融次次，离心；将上清液转入另一离心管中，加入等体积的消化缓冲液及蛋白酶（）消化，离心；将上清液转移到一新的离心管中，加入等体积的饱和酚，充分振荡混匀，离心；取上层水相转移入一新的离心管中，加入等体积的酚三氯甲烷异戊醇（）混匀后，离心（重复此步骤一次）；取上层水相转移入一新的离心管中，加入倍体积预冷的无水乙醇，在放置或室温放置以沉淀病毒；离心，弃去上清液，用乙醇洗涤沉淀，自然风干；用含（）的（）溶解沉淀，保存备用。或按照市售的抽提试剂盒操作说明提取病毒。犘犆犚扩增犘犆犚反应体系反应体系见表。表犘犆犚反应体系成分用量缓冲液引物引物犜犪狇聚合酶灭菌水总体积为体系，用旋涡混匀器进行混匀，瞬间离心，备用。扩增程序及反应条件将反应管置于扩增仪。反应参数为：预变性；再进行变性、退火、延伸，个循环；然后延伸，最后保存。产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。犛犖犜犘犆犚产物的电泳检测用电泳缓冲液配制成琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度）。将平板放入水平电泳槽中，加入电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将扩增产物与上样缓冲液混合，分别加入样品孔中，取加入到标准分子量对照孔内。恒压电泳。结果判定用凝胶成像系统进行分析。阳性样品扩增一条大小为的特异性条带，阴性对照和空白对照应无该特异性条带。在阴性和阳性对照成立情况下，如被检样品无条带，则结果为阴性，如被检样品有条带，大小为，即判定为水貂阿留申病毒核酸阳性。必要时取扩增产物进行序列测定，进一步确认待测样品的结果。如果出现与设计长度不同的条带，为非特异性反应，需重复试验，两次试验都为非特异性反应时，可判为阴性。实时荧光犘犆犚试验仪器、试剂仪器荧光检测仪、低温高速离心机、旋涡振荡器、冰箱、生物安全柜、组织匀浆器。可调微量移液器（、）、离心管和吸头（用水处理后高压灭菌备用，处理方法同上）、光学反应管。试剂所用水应符合中三级水的规格。蛋白酶、饱和酚、酚三氯甲烷异戊醇（）无水乙醇、乙醇、（）、（）、犜犪狇聚合酶（）、犜犪狇缓冲液、上游和下游引物均为，探针。商品化的荧光试剂盒可以用来进行荧光反应体系的配制。阳性对照同。阴性对照同。引物与探针根据水貂阿留申病毒（）国际标准株基因序列，在其保守的基因序列内设计合成一对特异性引物：上游引物，下游引物，犜犪狇探针（）（）均配制成，保存。犛犖犜犇犖犃抽提按照或按照抽提试剂盒操作说明提取病毒。同时设阳性对照和阴性对照。荧光犘犆犚检测荧光犘犆犚反应体系荧光反应体系见表。表荧光犘犆犚反应体系成分用量犜犪狇聚合酶犜犪狇缓冲液上游引物下游引物探针灭菌三蒸水总体积为体系，用旋涡混匀器进行混匀，瞬间离心，备用。荧光犘犆犚反应参数在检测区进行。将中加样后的管放入荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置：第一阶段，；第二阶段，、（在此收集荧光）、个循环。结果判定结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准阴性对照无值并且无扩增曲线。阳性对照的值应，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。结果描述及判定阴性无值并且无扩增曲线，表明样品中无水貂阿留申病毒核酸。阳性，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在水貂阿留申病毒核酸。犛犖犜附录犃（规范性附录）水、细胞培养液及试剂配制犃焦碳酸乙二酯（犇犈犘犆）双蒸水双蒸馏水室温放置以上，蒸汽高压。或室温保存。犃培养液（基础培养液）粉碳酸氢钠溶于双蒸水中，抽滤分装，保存。犃营养液培养液犊牛血清加青霉素、链霉素，使其浓度分别达到（）、（）抽滤除菌。犃维持液培养液犊牛血清加青霉素、链霉素使其终浓度分别达、，抽滤除菌。犃分散液胰酶乙二胺四乙酸二钠（）无钙镁抽滤除菌，保存备用。犃狆犎狆犎的三羟甲基氨基甲烷（犜狉犻狊）巴比妥钠缓冲液巴比妥钠三羟甲基氨基甲烷叠氮钠双蒸馏水二级水中溶解后，用盐酸将值调至，最后用二级水定容至。犛犖犜犃离心管、吸头处理方法离心管、吸头应放在水中浸泡以上，取出烘干水后再蒸汽高压，晾干后使用。犃蛋白酶犓（犿犵犿犔）（贮存液）三羟甲基氨基甲烷（）（）（）乙二胺四乙酸（）（）三蒸水加入蛋白酶，使成为，即为贮存液。使用浓度为。犃犚犖犪狊犲犃（犵犿犔）（）加去离子水使其终浓度为。分装，保存于备用。犃犜犈（狆犎）（）（）去离子水调节至，用去离子水定容至。犃犜狉犻狊冰乙酸（犜犃犈）电泳缓冲液冰乙酸（）三蒸水定容至蒸汽