DB21∕T 2591-2016 口蹄疫病毒非结构蛋白单抗阻断ELISA 检测方法

41  宁 省 地 方 标 准  25912016 口蹄疫病毒非结构蛋白单抗阻断of 2016 - 03 - 18发布 2016 - 05 - 18实施辽宁省质量技术监督局   发 布   25912016 I 目  次 前言 .  范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 缩略语 . 1 4 检测方法 . 1 材 . 1 剂 . 1 验步骤 . 2 果判定 . 2 效性判定 . 2 断率（的计算 . 2 定标准 . 2 血清样品 . 2 、羊血清样品 . 2 5 废弃物处理 . 2 附录 A（资料性附录） 主要试剂配方. 3 附录 B（规范性附录） 采样与样品处理注意事项. 4  25912016   言 本标准根据 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准由辽宁省质量技术监督局发布。 本标准负责起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院、世纪元亨生物技术有限公司。 本标准起草人：杨本勇、赵晓彤、艾纯民、刘坤洋、李井春、杨作丰、张雅为、邓文超、孙明、陈西钊、赵铁柱、夏伟  25912016 1 口蹄疫病毒非结构蛋白单抗阻断 范围 本标准规定了口蹄疫病毒非结构蛋白3检测方法、判定标准、废弃物处理等技术要求。 本标准适用于猪、牛、羊口蹄疫病毒感染的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。  6682 分析实验室用水规格和试验方法。 65482006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。            酶联免疫吸附试验（             口蹄疫病毒(          口蹄疫病毒非结构蛋白；        450             3，3，5，5四甲基联本胺 4 检测方法 材 量程为 100L 的精确微量移液器，200L 8或 12通道微量移液器，一次性移液器吸头，96 孔血清稀释板，37避光孵育箱，1000制洗涤液用），振荡器，酶标仪（含 450 自动或手动洗板系统，吸水纸。 剂 包被有口蹄疫病毒非结构蛋白抗原的96孔根过氧化物酶标记的抗口蹄疫病毒抗原的单克隆抗体；体积分数），质量浓度）牛血清白蛋白的用当日配制；含有硫酸溶液，标准所用化学试剂除另有特殊规定外，均为分析纯。试剂配制用水需满足 6682的要求。取动物全血， 25912016 2 待血液凝固后，4000r/集血清。要求血清清亮，无溶血。（血液采集与样品处理注意事项见附录B） 验步骤 稀释板上按 1：1 的体积比稀释待检血清（10000L 待检血清）。 记录表上记录阳性对照、阴性对照和样品的位置。分别在相应孔中加入阳性对照（2 孔）和阴性对照（3孔）原液（不用稀释）、稀释好的待检血清各 100L。充分混匀后，贴上封板膜，置 37孵育 60心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加满洗涤液，静置约30s，重复洗涤5 次，最后在吸水纸上拍净。 孔加入酶标抗体100L，贴上封板膜，置 37孵育30心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加满洗涤液，静置约30s，重复洗涤5 次，最后在吸水纸上拍净。 孔加入底物液 A 50L，再加入底物液 B 50L，轻振混匀，置 37避光显色10孔加入终止液 50L，轻振混匀，置酶标仪450果判定 效性判定 阴性对照 性对照阻断率均55%时试验成立，否则重做。 断率（的计算 阻断率（=（阴性对照孔阴性对照孔00% 定标准 猪血清样品 被检样品阻断率（30%，判为被检样品20%阻断率（30%，判为被检样品阻断率（20%，判为、羊血清样品 被检样品阻断率（40%，判为被检样品25%阻断率（40%，判为被检样品阻断率（25%，判为5 废弃物处理 检测过程中的废弃物，应收集后按006的要求处理。  25912016 3 A  A  附 录 A （资料性附录） 主要试剂配方 涤液 磷酸二氢钾（                   g 磷酸氢二钠（2             g 氯化钠（                        g 氯化钾（                         g 吐温20（                    蒸馏水或去离子水至                   1 000 物溶液                                  10超纯水定容至100水柠檬酸（2O）                   g                                g 75%过氧化氢尿素                        馏水或去离子水定容至                 100 止液  25912016 4 B  B  附 录 B （规范性附录） 采样与样品处理注意事项 样采集及处理过程，应进行无菌操作，防止样本因污染发生变质。存放血样的容器应无菌，或使用一次性灭菌容器。 液自然凝固后无菌分离血清装入灭菌离心管或小瓶中，加盖密