【基金标书】2010CB945300-胸腺与免疫细胞发育的分子调控

项目名称： 胸腺与免疫细胞发育的分子调控 首席科学家： 赵勇 中国科学院动物研究所 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部门： 中国科学院 一、研究内容 本项目将紧紧抓住“免疫器官及细胞发育分化”主题，重点围绕上述三个基 本科学问题，应用各种遗传修饰的模式动物（斑马鱼、小鼠、果蝇等）及发育生 物学、进化基因组学、分子细胞生物学等理论和技术手段，分以下 4 个课题深入 开展研究：课题 1 主要应用斑马鱼、小鼠模型，研究胸腺（胸腺上皮细胞及胸腺 细胞）发育及衰老的关键分子机制，阐明胸 腺上皮细胞与胸腺细胞相互作用的调 控规律；课题 2 首先应用斑马鱼报告系统获得对造血干细胞发生、维持和向淋巴 系发育的重要分子，然后应用小鼠模型，深入研究其对干细胞向淋巴细胞发育调 控的分子机制；课题 3 主要应用果蝇、小鼠及体外免疫细胞诱导体系，研究免疫 细胞向各亚群定向发育分化的调控机制；课题 4 主要应用进化 /比较基因组学方 法来研究与发现免疫系统发育相关的关键分子，并利用课题 1供的技术平台 与体系，进行验证和深入研究。 本项目 4个课题各有侧重，进行深入研究，又相 互关联与促进；作为一个研究整体，来阐 明胸腺及造血干细胞向成熟免疫细胞发 育的调控规律及发生机制。 二、预期目标 应用多种遗传修饰和基因突变模式动物（斑马鱼、小鼠、果蝇等）及进化基 因组学、免疫学、分子细胞生物学、生化等方面技术手段，重点研究免疫器官胸 腺及免疫细胞发育、分化和衰老过程中的重要调控因子及调控机理。通过本项目 的实验研究，解析免疫系统（特别是胸腺及其相关细胞）发育、分化与功能发挥 的关键分子调控线路，揭示免疫系统发育、分化与功能异常与人类健康的关系。 获得一批免疫系统进化、发育、功能相关重要基因和相关蛋白质，阐明一些关键 分子 的功能，为开发拥有自主知识产权的新型免疫制剂、免疫相关疾病诊断与防 治提供重要理论依据。在理论上有自己独到的创新性见解，在技术上建立一系列 研究免疫发育生物学基础理论的现代生物技术平台和先进技术体系。形成一支具 有国际影响和竞争力的研究团队，培养一批从事相关科学研究的中青年学术带头 人与后备力量。 五年预期目标 : 本项目将建立多种遗传修饰的斑马鱼和小鼠、移植动物模型、体外免疫细胞 发育分化诱导系统、果蝇天然免疫应答遗传筛选系统、免疫系统进化发育生物学 数据库等技术平台，形成一个先进而完整的免疫发育生物学研究 体系。揭示胸腺 发育与衰老、造血干细胞形成及其向免疫前体细胞发育分化、免疫细胞定向发育 分化的几个重要分子调控路线，获得一批重要的免疫发育相关的新基因 /蛋白质 及细胞亚型，并对其功能和调节机理进行系统研究，形成重要学术假说。力争在 理论上有突破，在技术上有创新。 具体指标如下： 1 建立一个先进的免疫发育生物学研究体系与技术平台，包括多种用于研究 免疫系统发育的遗传修饰和基因突变的果蝇、斑马鱼和小鼠，实验方法，技 术手段等。 2 阐明调控胸腺上皮细胞干细胞向胸腺上皮细胞发育分化及胸腺上皮细胞与 胸腺细胞 发育分化中相互作用的 2重要路线。 3 筛选一批参与胸腺和造血干细胞发育、分化、衰老与功能调控的重要基因， 并对其中 5关键基因进行调控机理研究，为发展新的免疫药物靶分子和 防治免疫相关疾病提供新思路。 4 解析免疫细胞不同亚群发育分化的 1主要分子通路，为有效调控免疫 应答提供重要依据。 5 在国际主流学术杂志上发表论文 80 90 篇，其中 0 的论文 12； 申请国家 /国外发明专利 5。 6 培养博士后 15，博士、硕士研究生 120 名左右。 三、研究方案 1）学术思路： 免疫系统发育与免疫应答是一个极为复杂的生命过程之一。根据目前国际发 展趋势和国内现有研究基础，本项目的总体思路是：应用发育生物学、进化基因 组学、蛋白质组学、系统生物学以及其他最新的理论与技术，凭借各种模式动物 等研究手段与平台，以重要免疫器官胸腺及免疫细胞发育为核心，主要深入探讨 胸腺上皮细胞干细胞向胸腺上皮细胞发育分化的重要调控通路，胸腺上皮细胞与 胸腺细胞发育中相互作用主要机理。同时，围绕胸腺这一免疫器官，我们将进行 淋巴细胞前体细胞及免疫细胞亚群发育调控的实验研究，从 而系统理解免疫细胞 发育的整个过程。总之，本项目将在基因进化和功能研究的基础上，通过研究基 因及蛋白质在分子、细胞和整体水平上的相互作用，揭示正常与异常免疫系统发 育过程的调控机理。具体课题设置见下图（图 1）。 造血干细胞免疫细胞亚群发育相关的重要基因 / 蛋白质回答科学问题：胸腺与免疫细胞发育的重要分子调控机制？意义：为免疫相关疾病的防治提供重要理论与技术基础。课题 1 ：胸腺（上皮细胞及胸腺细胞）发育及衰老的分子机制课题 2 ：造血干细胞发生、维持和向淋系发育的分子机制课题 3 ：免疫细胞亚群定向发育分化的调控机制课题 4 ：应用进化 / 比较基因组学方法研究免疫系统发育关键分子胸腺（上皮细胞、胸腺细胞）胸腺与免疫细胞造血干细胞免疫细胞亚群发育相关的重要基因 蛋白质回答科学问题：胸腺与免疫细胞发育的重要分子调控机制？意义：为免疫相关疾病的防治提供重要理论与技术基础。课题 ：胸腺（上皮细胞及胸腺细胞）发育及衰老的分子机制课题 ：造血干细胞发生、维持和向淋系发育的分子机制课题 ：免疫细胞亚群定向发育分化的调控机制课题 ：应用进化 比较基因组学方法研究免疫系统发育关键分子胸腺（上皮细胞、胸腺细胞）胸腺与免疫细胞图 1. 胸腺与免疫细胞发育的分子调控研究课题设置 主要科研流程见下图（图 2）。 图 2. 主要实验流程框架 2）技术途径： 本项目执行将主要依据已建立和将要建立的模式动物、体外细胞和组织培养 模型，通 过下述方法或途径分别在几个层次上阐明免疫器官（胸腺）和免疫细胞 已知免疫系统发育重要基因 / 蛋白质回答科学问题疾病发生、发展机制建立免疫系统发育研究平台阐明 5 - 6 个免疫系统发育相关重要基因调控线路干细胞 - - 胸腺 - - 免疫细胞 亚群发育（上皮细胞、胸腺细胞）未知免疫系统发育关键分子遗传修饰和突变果蝇、斑马鱼研究系统比较基因组学手段课题 1 - 3 课题 4 课题 1 - 4确定免疫系统发育重要基因干细胞 - - 胸腺 - - 免疫细胞 亚群发育（上皮细胞、胸腺细胞）课题 1 - 4遗传修饰的小鼠等分子生物学手段生物化学手段比较基因组学体外诱导体系基本问题 ：免疫系统发育的关键因素与调控机制已知免疫系统发育重要基因 蛋白质回答科学问题疾病发生、发展机制建立免疫系统发育研究平台阐明 个免疫系统发育相关重要基因调控线路干细胞 胸腺 免疫细胞 亚群发育（上皮细胞、胸腺细胞）未知免疫系统发育关键分子遗传修饰和突变果蝇、斑马鱼研究系统比较基因组学手段课题 课题 课题确定免疫系统发育重要基因干细胞 胸腺 免疫细胞 亚群发育（上皮细胞、胸腺细胞）课题遗传修饰的小鼠等分子生物学手段生物化学手段比较基因组学体外诱导体系基本问题 ：免疫系统发育的关键因素与调控机制发生、分化成熟的分子机理。 用 位杂交、 扰和过表达、基因报告系统等技术，检测基因在所研究细胞和组织中 的转录表达、定位及调控。 2. 蛋白质水平的研究：利用双向电泳、酵母双杂交、免疫共沉淀以及快速定点 突变和结构生物学技术研究蛋白质结构与功能的关系以及蛋白 用的分子机制。 3. 细胞与组织水平的研究：利用建立的各种细胞和组织培养体系和 流式细胞仪、 激光共聚焦显微镜、显微注射等技术，深入研究基因 /蛋白质的功能及调控网 络。 4. 整体水平的研究：涉及的多种模式动物包括果蝇、斑马鱼、小鼠。通过基因 诱变、转基因动物、基因敲除及转基因干细胞移植等技术建立实验模型，观察靶基因的功能。 5. 免疫分子的进化生物学研究：该研究主要用于筛选人类及相关模式动物的胸 腺及免疫细胞发育分化相关的基因和基因家族，研究其进化起源和功能分化的历史和动力学过程。 3) 创新点与特色： 立题新颖、前沿 ： 项目十分重视基础理论中的源头创新，对具有应用潜能的研究 将有自主 知识产权；以发育生物学的独特视角，研究免疫系统特别是胸腺相关细 胞发育的重要调控分子基础，阐明免疫系统发育分化的重要机制及相关疾病的发 病机理，处于当代生命科学研究前沿，具体研究内容国内外均未见详细的报道。 实验模型及研究手段先进： 选用的多种研究动物模型，包括条件性或细胞特异性 基因敲除和基因报告技术如（ ）基 因缺失小鼠， 基因斑马鱼等，着重在体内研 究重要调控基因在胸腺发育、胸 腺上皮细胞和淋巴细胞互作中的分子机理。应用 进化基因组学及生物信息学预测及分析相关重要基因及蛋白功能域。实验技术及 分析手段有特色。 学科交叉与优势团队 ： 研究团队由不同研究特色和学科研究人员（发育、免疫、 进化等）组成，学科之间交叉明显。同一位研究骨干可参与 2 个或多个课题研究 内容，各研究组之间将进行密切科研合作，共享实验技术平台和实验模型，将团 队优势挖掘出来，此为本项目的组织特色。 4）可行性分析： 本研究团队集结了国内在“分子 组织 层次以及免疫学、 细胞分子生物学及发育生物学等相 关领域中具有较好积累和特色实力的研究人 员。参与本项目的学术骨干在 J , J J 国际主流学术杂志上发表00 余篇。参与本项目的科学家一直活跃在本领域的科研前沿及积累了大量前期工作的基础（请见工作基础部分）。我们相信，通过学科交叉、优势互补、平台共享、协力攻关，在以下几方面取得重大进展是可行的。 1）通过 基因斑马鱼报告系统及实验室已建立的其它研究体系，在 发现重要调控胸腺上皮细胞干细胞和其发育的基因及理解其发育机制方面取得突破的可能性大。 2）利用业已建立的髓质区 T 细胞发育研究体系， 探索 胸腺上皮细胞功能 的影响，并揭示 陷导致胸腺细胞发育异常的机理和病理生理意义。工作基础坚实、推论合理、研究方案切实可行 ,取得突破的可能性大。 3）项目所需关键造血干细胞及淋巴细胞转基因斑马鱼报告系（ FP、制备并获得一些初步结果。因此，在确定造血干细胞发生及向淋巴细胞系发育中重要调控基因方面取得重大突破的可能性大。 4）通过酵母双杂交和 术，已发现一些参与免疫细胞活化的重要因子，因 此在探讨天然免疫细胞成熟及功能分化方面取得突破性进展的可能性大。 5）运用进化基因组学分子手段发现新基因功能，以结构和功能进化为导向确立 免疫系统发育关键蛋白 /多肽的功能表位方面取得重要进展的可能性大，获得免疫发育相关药物先导的可能性大。 四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 第 一 年 1）建立 色荧光转基因斑马鱼报告系统；应用此系统初步筛选对胸腺发育起重要作用的部分基因。 2）应用生物工程技术改造小鼠、移植动物模型及细胞分子生物学研究手段，研究候选基因（ 如 ）、 路、 胸腺上皮细胞干细胞及胸腺上皮细胞发育的作用及初步调控网络。 3）通过基因芯片等分子生化技术，初步筛选胸腺上皮细胞中作用的下游基因 /靶基因谱。 4）初步确定 胸腺髓质上皮细胞分化和功能的影响并确定其分子机制。 5）证实 端粒 关蛋白 胸腺及免疫细胞衰老过程中的作用及其与端粒动力学相关性。 6）建立胸腺上皮细胞及其干细胞分离、鉴定及定量分析的方法技术。 7）利用已有的不同基因缺陷小鼠（ 剔除小鼠）及疾病模型（感染、移植、肝炎等），初步研究 T 细胞亚群 (节性 T 细胞等 )分化的重要调节分子及其机制。 8) 培 育 出 -/ 的小鼠。 9)运用人的 库，通过人的初步确定 胸腺髓质上皮细胞分化和功 能的影响并确定其分子机制 。 初步筛选 胸腺上皮细胞中作用的下游基因 /靶基因谱。 证实 端粒 关蛋白 初步研究免疫细胞亚群 (特别是 节性 T 细胞等 )分化的重要调节分子。 确立三种模式动物免疫发育相关的候选基因，并完成相关的进化研究。 完成 录因子 和野生型和三种不同血细胞突变体斑马鱼( 胎发育不同时期中的时空表达图谱 。 在主流杂志上发表 论文至少6 篇。 年度 研究内容 预期目标 10） 参与果蝇天然免疫调控相关新基因的遗传和生化筛选。 11) 完成 录因子 和 胎发育不同时期中的时空表达图谱 。 12) 构建新 录因子相应的 达载体；设计并开展相关基因的反义寡聚核苷酸 验。 13) 开展小规模的 学诱变，初步筛选一批影响胸腺和 T 细胞发生的突变体。 14) 进行相关 基因进化分析。确立三种模式动物免疫发育相关的候选基因，并完成相关的进化研究。建立和完善本课题相关的各种技术平台。 第 二 年 1）进一步凭借 色荧光转基因斑马鱼报告系筛选对胸腺发育发育起重要作用的部分基因。 2）应用生物工程技术改造小鼠、移植动物模型及细胞分子生物学研究手段，较深入研究候选基因（如 ）、 路 等在胸腺上皮细胞干细胞及胸腺上皮细胞发育、衰老的作用及调控网络。 3）确定 胸腺髓质上皮细胞分化和功能的影响并确定其分子机制。 获得一批对造血、胸腺、免疫细胞发育有影响的基因 。 初步构建较系统的造血干细胞基因调控网络模式图。 分析 端粒 关蛋白 获得 相关 基因进化表位的基础数据 ，得到初步结论。 在主流杂志上发表论文至少年度 研究内容 预期目标 4）系统分析 端粒 关蛋白 胸腺及免疫细胞衰老过程中的生物作用及其与端粒动力学相关性。 5）进一步利用不同基因 缺陷小鼠，研究这些基因在 T 细胞亚群 (节性 T 细胞等 )分化的可能作用及其调控机制。 6） 对候选 基因进行初步的功能分析。 7） 利用 基因和双基因剔除小鼠，初步探讨 径在免疫细胞发育中的作用以及它们的协同作用机制。 8) 开展功能缺失和过量表达实验 ，确定 阐明其与其它相关主控基因的上位关系 。 9) 完成中小规模的 学诱变，确定一批影响胸腺和 T 细胞发 育 的重要 斑马鱼 突变体。 10) 预测重要相关蛋白的进化表位 ； 基因克隆，表达载体构建和重组蛋白的生产方案的优化。 11） 获得进化表位的基础数据。克隆相关的基因并选择不同的表达载体优化表达和纯化方法。 10 篇。 第 三 1）建立 1生物工程技术改造小鼠，确定1对胸腺上皮细胞 及胸 腺细胞 分化和功能具有重要影响的新功能基因。 2）较深入研究 几个 候选基因在胸腺上皮细胞确定 1对胸腺髓质上皮细胞发育和功能具有重要影响的新功能基因。 确定造血干细胞在斑马鱼胚年度 研究内容 预期目标 年 干细胞及胸腺上皮细胞发育的作用及调控分子网络。 3） 完成利用不同基因基因缺陷小鼠，研究这些基因在 T 细胞亚群 (节性 T 细胞等 )分化的可能作用及其调控机制。 4 ） 检测 -/双基因敲除小鼠的细胞亚群，炎性因子的变化及组织病理变化。 5） 深入探讨 条途径在免疫细胞发育中的作用以及它们的协同作用机制 6） 主要利用敲除、干扰或过量表达 等方法初步分析目的 免疫细胞发育过程中的调控作用 。 7） 确定造血干细胞在斑马鱼胚胎时期的起源、发育分化和迁移路线。 8）完成构建较系统的造血干细胞基因调控网络模式图，并阐明 录因子在血液发生、保持和淋系分化中的分子机制。 9）开展定位克隆影响造血干细胞、 T 淋巴细胞及胸腺发育的重要突变体 /基因。 10） 运用反向 法完成丙氨酸突变体重组表达载体的构建， 确定相关蛋白的 重要 功能 位点 。 胎时期的 起源、发育分化和迁移路线。 完成构建较系统的造血干细胞基因调控网络模式图 。 明确 1对免疫细胞亚群发育有重要作用的调节通路。 明确 1对免疫细胞亚群发育有重要作用的分子表位特征及进化特点。 在主流杂志上发表论文至少15 篇。 年度 研究内容 预期目标 第 四 年 1）建立目的基因缺失小鼠，证实 1对胸腺发育具有重要影响的新功能基因。 2）较深入研究候选基因在胸腺上皮细胞干细胞及胸腺上皮细胞发育