抗体的制备

抗体的制备,李成仁组织学与胚胎学教研室,一、一些基本概念,1. 克隆(clone)是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团,抗原(antigen，Ag),2. 抗原决定簇 是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope)，抗原结合位点,Ag,1,2,3,4,3.单克隆抗体 (Monoclonal Antibody, McAb) 由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。4.多克隆抗体 (Polyclonal Antibody，pAb) 用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。,Ag,单克隆抗体,B1,B2,B3,B4,B3,B3,B3,B3,2,多克隆抗体,3,4,1,单克隆抗体的特点,抗体的性质相同，容易纯化、标记。特异性强，具有抗原结合位点的专一性。(不是抗原的专一性！)因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应。,但单克隆抗体有交叉反应 是由于不同的抗原上有完全相同的表位(100%的交叉反应)，或有相似的表位(不同程度的交叉反应)。,多克隆抗体的特点,多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质。特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。,比单抗更容易捕捉抗原。 因为含有抗不同表位的抗体，多种抗 体都可与抗原结合。,抗体的纯化、标记比单抗难 因为含有各种不同类型、亚类的抗体， 提纯、标记的方法有所差别。同时，血 清中含有的杂蛋白比较多。,购买抗体时要注意厂商的标注,适合于做什么实验，使用浓度多少WB（Western blotting ，免疫印迹)IHC (Immunohistochemistry, 免疫组织化学)ICC (Immunocytochemistry, 免疫细胞化学)IEM (Immunelectron microscopy,免疫电镜)FCM (Flow Cytometry,流式细胞仪)ELISA(enzyme linked immunosorbent assey, 酶联免疫吸附实验，酶联免疫分析),抗体的制备技术经历了三代：第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）；第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。,抗体制备技术,一、多克隆抗体制备（一）免疫原的制备（二）免疫动物（三）免疫血清的纯化（四）免疫血清的鉴定（五）免疫血清的保存二、单克隆抗体制备（一）单克隆抗体制备原理,（二）单克隆抗体制备的技术要点（三）影响杂交瘤技术的因素（四）单克隆抗体的应用三、基因工程抗体技术（一）人源化抗体（二）小分子抗体（三）双特异性抗体（四）抗体库技术,抗体制备技术,二、多克隆抗体制备,(一)免疫原的制备免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）免疫原天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原,1. 颗粒性抗原的制备 (1)红细胞抗原的制备： A、新鲜血经无菌NS洗涤3次，取压积红细胞并配制成25%，直接进行注射免疫。 B、新鲜血+抗凝剂 4保存4W，免疫前取适量抗凝绵羊血，按A处理。 C、新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。,(2)细菌抗原的制备：取标准菌株，接种。 H抗原：取有动力的菌株液，用0.30.5%甲醛处理。 O抗原：菌液于1002.5h。 Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶液。(3)虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫卵悬液。,(4)组织细胞粗抗原：所用的组织必须是新鲜或处理后低温(-40)保存的。器官或组织材料得到后立即去除表面的包膜或结缔组织及大血管，用无菌NS进行灌注、洗涤至没有残血、污物，在冷浴中将组织剪成小块后粉碎(匀浆)/消化。,粉碎方法有两种，一是高速组织捣碎机法：注意要高速(1万rmp)，间断(每次30秒1min)进行，时间过长会导致产热，破坏抗原。另一种是研磨法(有时加入洗过的海沙使研磨更有效)。匀浆液经离心，沉淀中含大量的组织细胞和碎片，上清液可提取可溶性抗原。消化是用胃蛋白酶或胰酶，通过酶解将细胞间质消化，获得游离单个细胞。,2. 可溶性抗原的制备 可溶性抗原可分为：细胞膜蛋白抗原、细胞浆抗原、细胞核及核膜抗原。(1)细胞破碎：有如下方法： A、反复冻融法：置-15-20 冻结，然后缓慢融化，反复2次，大部分细胞因胞内冰晶的形成和溶剂浓度的突然改变而被融破。此法适用于组织细胞，对微生物的细胞作用较差。,B、冷热交替法：将材料投入沸水中，90 左右维持数分钟，立即置于冰浴中。在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用此法。C、超声波破碎法：是利用超声波的机械振动而使细胞破碎的方法。微生物和组织细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子则较难打破。,D、酶处理法：酶在一定的条件下能消化细菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶菌酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用于多种微生物。 E、表面活性剂处理：在一定的条件下，表面活性剂能与细胞膜脂蛋白形成微泡，使膜的通透性发生改变而使细胞破碎。提取核酸时常用此法。F、自溶法：利用组织和微生物的自身酶系，在一定条件下使细胞溶解。,(2)蛋白质抗原的制备：破碎的细胞按一定要求纯化，可获得不同成分的抗原。A、超速离心法：利用各抗原在梯度液中沉降速度不同，达到区带分离的目的。这是分离亚细胞部分和蛋白质大分子的有效手段。,B、选择性沉淀：是采用各种沉淀剂或改变条件使抗原成分沉淀而达到分离的目的。a、核酸除去法：用DNA/RNA酶降解或用氯化锰/硫酸鱼精蛋白/链霉素作沉淀剂去除核酸。b、盐析沉淀法：用不同饱和度的硫酸铵或硫酸钠。例如:用40、35、33%的硫酸铵分次提取或用20%硫酸钠提取，即可获得丙种球蛋白(含IgG 95%以上) 。,c、有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低而沉淀，有些有机溶剂能破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀，例Cohn地温酒精可将血浆蛋白分为五组。IgG属Cohn。d、其它沉淀剂：常用聚乙二醇(PEG)和硫酸葡聚糖。PEG浓度34%可沉淀IC，67%沉淀IgM，812%沉淀IgG，1215%沉淀其它球蛋白，25%则沉淀白蛋白。,C、凝胶层析法：利用凝胶的多孔网状结构，大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分子进入网孔，难于洗脱，将抗原分为大、中、小三种。属区带分离法。D、离子交换层析：利用带离子基团的纤维或凝胶，吸附带相反电荷的抗原。,凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理,E、亲和层析：利用生物学分子间所具有的专一亲和性而设计的层析方法。Ag-Ab, 激素-受体，酶-酶配体，酶蛋白-辅酶。,亲和层析的作用机理,(3)核酸抗原的制备：细胞破碎液去除蛋白质(常用酚和氯仿抽提)后，用沉淀剂(常用乙醇)沉淀核酸。(4)脂多糖抗原的制备：苯酚提取法。(5)Ig片段的制备：酶裂解法Fc、Fab 氧化/还原法：轻、重链。,(6)纯化抗原的鉴定： 鉴定蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。蛋白的含量定氮（紫外光280nm等）分子的质量电泳、质谱蛋白的纯度电泳等免疫学活性免疫双扩散、免疫印迹,(二)半抗原免疫原的制备：利用某些功能 团将半抗原连接到载体上。1、载体的选择：A、蛋白质：人/牛/兔白蛋白、牛甲状腺球蛋白和血蓝蛋白等。最常用牛白蛋白。B、多肽聚合物：多为人工合成(多聚赖氨酸)。C、大分子聚合物和某些颗粒：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，羧甲基纤维素，活性碳，乳酸等,2. 连接方法：半抗原与载体的连接有物理法和化学法。物理法：用吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等；化学法：利用某些功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。,A、碳化二亚胺法 B、戊二醛法C、氯甲酸异丁酯法 D、琥珀酸酐法E、0-羧甲基羟胺法 F、一氯醋酸钠法G、重氮化的对氨基苯甲酸法,(三)佐剂：与抗原同时或预先注射于机体，能增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质，称为佐剂。1、佐剂的条件：A、增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增加抗原的免疫原性。,B、与抗原结合能延长抗原在局部组织中的存留时间，达到持续刺激基团产生高效价的抗体。C、 可以激活免疫活性细胞，增强体液免疫、细胞免疫和非特异免疫功能。D、 无毒、无副作用。,2、常用佐剂的种类和制备：A、铝乳：5%硫酸铝+5%NaOH，反应后NS洗涤沉淀2次以上。1:1与抗原混合。B、明矾：硫酸钾铝在一定pH下产生氢氧化铝胶体。制备方法是：Ag+NS，搅拌下缓慢滴入10%的硫酸铝钾溶液，以NaOH校正pH至6.5，离心、NS洗涤。,C、福氏佐剂：分为不完全佐剂(石蜡油+羊毛脂)和完全佐剂(石蜡油+羊毛脂+卡介苗)。1:1与抗原混合研磨均匀即可。但完全福氏佐剂局部注射因易形成肉芽肿和持久溃疡而不用于人体免疫。,(四)免疫动物,为获取高质量(特异性强和效价高)的抗体，除了需制备质量好纯度高的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、注射途径、注射次数、注射间隔和接种动物的年龄均与免疫效果密切的关系。,1. 用于免疫的动物：主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗体数量来选择。抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。抗原性质与动物种类。,兔子(rabbit)：最常用于自制抗体，抗体量较多。最好用纯种新西兰兔， 大耳白，体重以23kg为宜。小鼠(mouse)：可用于自制抗体，但 抗体量很少。一般用BALB/C和昆明鼠大鼠(rat)：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。常用Wistar大鼠,羊(sheep、goat)：常用于较大批量地 生产抗体(商品)。马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。豚鼠(guinea pig)：国外实验室常用。,2. 免疫途径,免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。,1、基础免疫：首次抗原剂量大， 300500g，用福氏完全佐剂。2、加强免疫：第2次以后，抗原量为首次剂量的1/41/2，用福氏不完全佐剂，每24周加强免疫一次，多次。,（三）免疫的基本步骤,3、取血测效价：加强免疫两次或三次以后的第7天取血。制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。,免疫34次以后从耳静脉取血检测效价 酶联法：1:104以上，能达到1:106。 免疫双扩散：1:16以上，能达到1:64效价达到要求的可放血制备血清 可一次放血(颈动脉或心脏) 也可多次取血(耳静脉) 放血过程中要严格按无菌要求进行。,图1 颈动脉分离图,抗体反应,4、放血制备血清：最后一次免疫后7-10天放血。在三角瓶中加一些生理盐水，放血后室温下放置1h左右让血液凝固，置4下过夜(切勿冰冻)析出血清，吸取血清，离心， 4000rpm，10min。在无菌条件，吸出血清，分装(0.050.2ml)，贮于-40以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。,1、效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。常用放射免疫法，对所有的抗体均适用。某些由大分子抗原所产生的抗体，也可用双扩散法测定。前者极为精确，而后者粗糙。(1)放射免疫法：以不同稀释度的抗体与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度为效价。,（四）抗体质量的评价,(2)双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。中央孔内加适量抗原(容量为50l)，周围各孔内分别加入50l 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及不稀释的抗血清，37下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度,2、特异性或专一性：是指抗体对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。通常，以交叉反应率来表示的。3、亲合力：是指抗体与抗原结合的活度或牢固度。亲合力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。,(五)免疫失败的可能原因及措施,(1)免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。 (2)抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。,(3)制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂、载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。(4)所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。,(5)免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。 (6)动物的饲养是否得当，如营养(饲料、饮水)、环境卫生(通风、采光、温度)是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。,五、免疫血清的保存,1、4保存（6个月）2、低温保存（-70 -20 ，5年）3、真空干燥保存（5 10年）注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）,四、单克隆抗体的制备,单抗 多抗抗体组成 单一 复杂 抗体性质 个体的属性 群体综合的性质纯化标记 容易，效果好 难度高一些 种属来源 绝大多数是小鼠 兔子、羊、豚鼠等制备周期 长 (最短4个月） 短（2个月）制备技术 复杂 简单经费 多 少,一、杂交瘤技术的原理及流程,(一)动物的选择,多选用纯种bala/c小鼠。,712周龄20g25g体重,(二)免疫动物,应根据抗原的特性不同而定，一般在融合前两个月左右开始免疫。,初次免疫：皮下多点注射或脾内注射，加福氏完全佐剂,3W,第二次免疫：皮下或腹腔内注射，加福氏不完全佐剂,3W,第三次免疫：腹腔内注射，不加佐剂。,采血测其效价,57D,加强免疫：腹腔内注射或静脉内注射,23W,3D,取脾融合,(1)可溶性抗原免疫原性较弱 ，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如：将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。,(2)颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为12107个细胞。初次免疫1107/0.5ml腹腔内注射 23周后第二次免疫1107/0.5ml腹腔内注射 3周后加强免疫(融合前三天)1107/0.5ml腹腔内注射或静脉内注射 取脾融合,（二）细胞融合,1、细胞融合前准备(1)骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量单抗。,最常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653,小牛血清的浓度一般在10%20%，细胞浓度以1045105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：31：10的比例传代 。每35天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理。,(2)饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3t3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2104或105细胞/孔。,巨噬细胞,2细胞融合的步骤(1)制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞，与免疫小鼠相同品系的小鼠。,(2)制备免疫脾细胞最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死无菌取脾脏，培养液洗 一次脾脏研碎，过不锈钢筛网离心，细胞用培养液洗2次计数取108脾淋巴细胞悬液备用,（3）制备骨髓瘤细胞取对数生长骨髓瘤细胞离心用无血清培养液洗2次计数，取得107细胞备用（4）融合将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm，8min，弃上清。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。,90s内加入37预温的1ml 45%聚乙二醇溶液，边加边轻微摇动。37水浴作用90s。加37预温的不完全培养液以终止聚乙二醇作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。离心，800rpm, 6min。充上清，用含20%小牛血清hat选择培养液重悬。将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100l。将培养板置37、5% CO2培养箱中培养。,聚乙二醇PEG是最常用的细胞融合剂。PEG可能的作用机理： PEG导致细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合。PEG的细胞融合作用完全是随机发生的。一般选用分子量4000 的PEG作为细胞融合剂。不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同。,(三)选择杂交瘤细胞及抗体检测,1、 HAT培养基选择杂交瘤细胞：,H(Hypoxanthine, H)次黄嘌呤； A(Aminopterin)氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine, T)胸腺嘧啶核苷；供细胞通过替代途径合成DNA。,骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能在hat选择培养液中生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，可以生长繁殖。,在用hat选择培养12天内，将有大量瘤细胞死亡，34天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，hat选择培养液维持710天后应换用ht培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每23天换一半培养液 。,2、抗体的检测：检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有：(1)放射免疫测定：可用于可溶性抗原、细胞单抗的检测。(2)酶联免疫吸附试验可用于可溶性抗原、细胞和病毒等单抗的检测。(3)免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的单抗的检测。(4)其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。,（四）杂交瘤的克隆化,是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过hat筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆，可能会有数个克隆。原则是，对于检测阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制。即使克隆化过的杂交瘤细胞