麝香保心丸对自发性高血压大鼠心脏保护作用的研究

精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创1/14麝香保心丸对自发性高血压大鼠心脏保护作用的研究作者胡送友，田登科，陈刚领，刘俊，可燕，卞卡作者单位上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海201203；上海中医药大学教学实验中心，上海201203；美国德克萨斯大学休斯顿医学院综合生物及药理学系，德克萨斯大学分子医学研究所，休斯顿TX77030【摘要】目的探讨麝香保心丸（HMP）对自发性高血压大鼠（SHR）心脏保护作用及其可能的机制。方法将6周龄SHR分为HMP治疗组、高血压模型组,将WKY大鼠作为正常血压组，每组分3批在3个时间点（给药6周、给药14周、停药9周）处死大鼠，尾套法测定血压；FRAP法进行心脏组织总抗氧化能力测定；采用RTPCR考察炎症相关因子ICAM1、VCAM1、IL1和TNFMRNA表达；WESTERNBLOT与ELISA法分别考察炎症相关因子ICAM1、VCAM1及IL1、TNF蛋白表达。结果HMP对SHR无明显降压作用，但能提高SHR心脏组织总抗氧化能力。PCR、WESTERNBLOT与ELISA显示给予HMP6周和14周后，均能显著抑制SHR心脏炎性相关因子ICAM1、VCAM1MRNA表达及ICAM1蛋白表达；给药14周后，能显著抑制炎性相关因子IL1、TNFMRNA表达及蛋白表达；停药精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创2/149周后，仍能抑制炎性相关因子ICAM1、TNFMRNA表达及ICAM1蛋白表达。结论HMP具有独立降压以外的对SHR心脏保护作用，其机制可能与抑制心脏组织炎症反应及降低组织氧化应激有关。【关键词】麝香保心丸自发性高血压大鼠炎症心脏原发性高血压PROTECTIVEEFFECTOFHEARTPROTECTINGMUSKPILLONHEARTINSPONTANEOUSLYHYPERTENSIVERATSHUSONGYOU,TIANDENGKE,CHENGANGLING,LIUJUN,KEYAN，BIANKAMURADRESEARCHINSTITUTEFORMODERNIZEDCHINESEMEDICINE,SHANGHAIUNIVERSITYOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE,SHANGHAI201203,CHINAEXPERIMENTCENTERFORTEACHINGDEPARTMENTOFINTEGRATIVEBIOLOGYANDPHARMACOLOGY,INSTITUTEOFMOLECULARMEDICINE,UNIVERSITYOFTEXASMEDICALSCHOOL,6431FANNIN,HOUSTONTX77030,USAABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHEPROTECTIVEEFFECTOFHEARTPROTECTINGMUSKPILLHMPONHEARTINSPONTANEOUSLYHYPERTENSIVERATS精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创3/14SHR,ANDITSPOSSIBLEMECHANISMSMETHODS6WKOLDMALESHRWERERANDOMLYDICIDEDINTOTHEHMPTREATMENTGROUPANDMODELAGEMATCHEDMALEWISTARKYOTOWKYNORMOTENSIVERATSWEREUSEDASTHECONTROLGROUPRATSINEACHGROUPWEREPERIODICALLYDECAPITATEDINBATCHATTHREETIMEPOINTS6WEEKTREATMENT,14WEEKTREATMENT,AND9WEEKPOSTTREATMENTSYSTOLICBLOODPRESSURESBPWASMEASUREDBYTAILCUFFMETHODTOTALANTIOXIDANTCAPACITYOFHEARTWASEVALUATEDWITHFRAPMETHODRTPCRWASUSEDTOMEASURETHEMRNAEXPRESSIONOFINFLAMMATIONRELATEDMEDIATORSICAM1,VCAM1,IL1ANDTNFTHEPROTEINEXPRESSIONOFINFLAMMATIONRELATEDMEDIATORSICAM1,VCAM1,IL1,TNFWASDETERMINEDBYWESTERNBLOTANDHADNOMARKEDEFFECTONSBP,BUTCOULDELEVATETOTALANTIOXIDANTCAPACITYOFHEARTINSHRPCR,WESTERNBLOTANDELISASHOWEDTHATHMPCOULDINHIBITICAM1,VCAM1MRNAEXPRESSIONANDICAM1PROTEINEXPRESSIONOFHEARTINSHRAFTER6WEEKSAND14WEEKSOFTREATMENT,INHIBITIL1,TNFMRNAEXPRESSIONANDPROTEINEXPRESSIONAFTER14WEEKSOF精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创4/14TREATMENT,ALSOINHIBITICAM1,TNFMRNAEXPRESSIONANDICAM1PROTEINEXPRESSIONAFTER9WEEKSOFPOSTTREATMENTCONCLUSIONHMPHASPROTECTIVEEFFECTONHEARTINDEPENDENTOFITSHEMODYNAMICEFFECTONSBPTHEMECHANISMMAYBEASSOCIATEDWITHTHESUPPRESSIONOFINFLAMMATORYRESPONSEANDTHEDECREASEOFOXIDATIVESTRESSOFHEARTKEYWORDSHEARTPROTECTINGMUSKPILLSPONTANEOUSLYHYPERTENSIVERATSINFLAMMATIONHEARTHYPERTENSION高血压病会引起血流动力学异常变化和血管重塑，导致心、脑、肾等靶器官损害。心肌肥大，心肌间质纤维化及大小冠脉血管结构和功能的改变是高血压靶器官心脏的主要损害，从预后意义来讲，是最严重的并发症。降低并控制血压的同时，逆转或减轻高血压靶器官损害已成为国际上高血压病治疗的主要目标。炎症反应不仅参与了高血压的发生发展，更是与高血压心、脑、肾等多个靶器官损害密切相关1。我们中心先期研究的结果也表明,自发性高血压大鼠多个靶器官存精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创5/14在着明显的炎症状态存在2。麝香保心丸是最具代表性的治疗冠心病的有效中成药，动物实验和临床研究证明3，4，有抗心肌缺血、保护心肌作用，但其作用机制仍未阐明，本实验通过观察麝香保心丸对自发性高血压大鼠（SHR）心脏炎症状态和氧化应激的影响，探讨麝香保心丸的心肌保护作用及其可能的机制，为其临床应用及二次开发提供新的依据。1器材与方法动物与药物SPF级SHR36只，WKY大鼠18只，均为雄性，6周龄，由中科院上海实验动物中心提供，合格证号SCXK（沪）20070005。麝香保心丸由上海和黄药业有限公司生产批号G060601。试剂及仪器TRIZOLRNA提取试剂均购于SIGMA公司；RTPCR试剂盒为BIODEVTECH公司产品；引物由上海生物工程技术公司合成；抗体均购于SATACRUZ公司；IL1ELISA试剂盒（批号RT110371）与TNFELISA试剂盒（批号RT110371）均购于美国ADL公司。PCR扩增仪，德国BIOMETRA公司；UV1700紫外分光光度计，日本岛津公司；GIS凝胶图像分析系统，上海天能科技有限公司产品；NIBP鼠尾无创血压测量分析系统，上海奥尔科生物科技有限公司产品；SPECTRAMAX190酶标精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创6/14仪，美国MOLECULARDEVICES公司产品；D78532高速冷冻离心机，德国HETTICH公司产品；超低温冰箱，美国THERMO公司产品。动物分组及给药将36只SHR随机分为麝香保心丸（HMP）组和SHR模型（SHR）组，每组18只，以同周龄的WKY大鼠为正常对照（WKY）组，每天上午800900HMP组每只大鼠给予麝香保心丸MG/KG溶于1ML蒸馏水中灌胃；WKY组与SHR组给予相同体积的蒸馏水。分别在给药6周、给药14周和停药9周后分3批处理动物。检测指标血压测定采用尾套法，将大鼠于38预热箱中预热10MIN，测量大鼠在安静、清醒状态下的尾动脉压3次，取其平均值。动物处理及心脏组织总RNA、蛋白提取采用大鼠腹腔注射40MG/KG戊巴比妥钠麻醉，颈椎脱臼处死，取出心脏组织液氮速冻后80保存，用于总RNA、蛋白样品制备。取大鼠冻存心脏组织50100MG，加1MLTRIZOL试剂，按照试剂使用说明提取总RNA，所用RNA的A260/A280均在之间。取大鼠心脏组织约200MG，在2ML中含有蛋白酶抑制剂的PBS（）中匀浆组织，4离心15MIN两次，取上清即为总蛋白样本。逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）按照RT试剂盒说精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创7/14明书进行CDNA的合成，PCR扩增所需引物序列及反应条件如表1所示，ACTIN作为内参照。扩增产物于琼脂糖凝胶电泳，以上海天能图像分析系统对所得条带光密度进行扫描分析。表1PCR反应所需引物序列及条件目的基因引物序列退火温度T/产物大小（略）蛋白质印迹（WESTERNBLOT）分析BRADFORD法测定组织蛋白质水平，按照50G蛋白样品上样；总蛋白样品加上样缓冲液，100煮沸5MIN；聚丙烯酰胺凝胶SDSPAGE电泳分离总蛋白；然后将总蛋白转移至硝酸纤维素膜；用5的脱脂奶粉室温下封闭1H，PBST洗膜3次，5MIN/次；然后一抗VCAM1（1400）,ICAM1（1400），GAPDH（11000）4孵育过夜；PBST洗膜3次，5MIN/次，结合有辣根过氧化酶标记的相应二抗（14000）孵育1H,增强发光剂（ECL）显色；以GAPDH蛋白表达校正作灰度相对分析。心脏组织总抗氧化能力测定采用FRAP法5，6，250L反应体系5L心脏组织蛋白样品和245LFRAP工作液在37反应10MIN后，分别以PBS和水溶性维生素E（TROLOX）作为空白和标准对照，于593NM处测定吸光度值。组织总抗氧化活性（FRAP值）以达到同样吸光度所需的TROLOX的毫摩尔数表示，结果以MTROLOX/GPROTEIN表示。精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创8/14ELISA测定将蛋白样品稀释100倍后，按IL1ELISA试剂盒与TNFELISA试剂盒说明书操作，分别检测心脏组织炎性因子IL1与TNF蛋白表达水平。结果以NG/MGPROTEIN表示。统计学方法各组结果以S表示,组间差异用单因素方差分析和Q检验。P2结果HMP对SHR血压值的影响由表2可见，模型组SHR收缩压较正常对照WKY大鼠明显升高P。表2HMP对SHR血压值的影响（略）HMP对SHR心脏ICAM1和VCAM1表达的影响如图1A、1B、1C所示，模型组SHR心脏ICAM1和VCAM1的MRNA表达显著高于正常WKY组PHMP对SHR心脏IL1和TNF表达的影响如图1A、1D、1E所示，模型组SHR心脏TNF的MRNA表达显著高于正常组PHMP对SHR心脏总抗氧化能力的影响由表4可见，12，20，29周龄SHR心脏组织总抗氧化水平均明显低于WKY（P3讨论高血压病对靶器官心脏的主要损害是心肌肥大，心肌间质纤维化以及大小冠脉血管结构和功能的改变。长期的压力负荷会导致心肌细胞肥大、间质胶原增多。心肌胶原基质的聚集和纤维化使心脏的顺应性和舒张功能降低。上精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创9/14述变化的发生是由心脏机械因素或体液因素所激活，并有多种生长因子及血管活性物质所介导，如血管紧张素（ANG）、醛固酮等。ANG通过其型受体（ATR）介导胶原生成，使蛋白质合成增加，心肌细胞发生肥大。另一方面，缓激肽、前列腺素、NO能够使胶原降解。胶原合成与降解比例失调最终导致心肌肥厚的发生。本实验结果显示SHR7周龄时动脉收缩压明显高于同龄WKY，且血压随年龄增加而升高，29周龄时血压已显著高于同龄WKY，提示7周龄SHR可能已产生心肌损伤。HMP有抗心肌缺血、保护心肌作用，但其作用机制仍未阐明。本实验以SHR为高血压心脏损害动物模型，结果发现给予HMP6周和14周后，能显著抑制SHR心脏炎性相关因子ICAM1、VCAM1MRNA表达及ICAM1蛋白表达；给药14周后，能显著抑制炎性相关因子IL1、TNFMRNA表达及蛋白表达；停药9周后，仍能抑制炎性相关因子ICAM1、TNFMRNA表达及ICAM1蛋白表达。众多证据显示710,炎症反应可能参与了高血压心脏损害。使用免疫抑制剂CSA影响NFB依赖信号通路或者使用NFB的抑制剂治疗DTGR大鼠，均能减轻炎症细胞浸润和心肌肥厚。ICAM1、VCAM1可介导白细胞与内皮细胞粘附，白细胞粘附于内皮细胞和组织浸润，导致组织损伤，精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创10/14是炎症反应重要的标记物7。YOKOYAMA报道8心肌细胞与激活的单核细胞体外培养，心肌细胞蛋白合成增加，在加入抗ICAM1单克隆抗体后，心肌细胞蛋白合成受到显著抑制。IL1可使肾上腺素受体与腺苷酸环化酶脱耦联，心肌收缩力降低。研究报道9压力负荷刺激巨噬细胞趋化因子表达增加，引起巨噬细胞大量聚集，巨噬细胞产生许多细胞因子，以IL1分泌尤为显著，其能促进心肌细胞的生长和左室重构。连续给大鼠腹腔注射TNF会使左室功能时间依赖性降低并伴随左室肥厚，机制可能是使心肌细胞外基质金属蛋白水解酶活性增加,导致基质降解,同时刺激成纤维细胞增殖,参与心室重构10。SUN2对SHR高血压靶器官心脏组织炎症状态考察后，发现SHR心脏组织炎症相关因子ICAM1,TNF,IL1，PPAR显著高于WKY，提示SHR心脏存在着明显的炎症状态。由此可见炎性相关因子ICAM1,VCAM1，TNF,IL1在高血压心脏损害中起着重要作用。本实验研究发现HMP对SHR的血压无明显影响，说明HMP可能是通过抑制心脏组织炎症反应对SHR心脏起保护作用，且这种作用是独立于降压作用的。已有研究显示11SHR心脏重量与体重之比在高血压前期（如34周精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创11/14龄）以较WKY明显增加，心脏后乳头肌心肌细胞增大。甚至有研究发现，SHR左室重量与体重之比早在刚出生时即较同龄WKY明显增加。说明SHR心脏肥大可能并不完全与高血压病有关。炎症损伤多伴随大量ROS的产生，如O2、HO和H2O2，导致氧化应激的产生。ROS可直接修饰蛋白质、脂质、糖类和DNA，引起组织损伤。ROS还可通过激活对氧化还原敏感的核转录因子NFB，上调粘附分子、细胞因子、趋化因子等促炎因子的表达，如ICAM1、IL1、TNF等，引起血管炎症。过量产生的O2可消耗NO生成氧化能力更强的过硝基阴离子（ONOO），使NO的生物利用度降低，损伤血管的舒张功能12,13。此外，O2水平的增加，能通过下调可溶性鸟苷酸环化酶（SGC表达、抑制SGC活性和CGMP依赖性蛋白激酶CGK1活性而影响平滑肌层的NO/CGMP信号途径从而影响血管功能14。本实验研究发现12，20，29周龄SHR心脏组织总抗氧化水平均明显低于WKY，提示SHR心脏组织存在着明显的氧化应激状态。给予HMP6周和14周后，均能够显著提高SHR心脏组织总抗氧化水平，在停药9周后，心脏组织总抗氧化水平仍明显高于SHR组，说明HMP能降低SHR心脏组织的氧化应激。精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创12/14总之，本研究证明SHR心脏确实存在氧化应激和炎症状态。HMP具有独立降压以外的对SHR心脏保护作用，其机制可能与抑制心脏组织炎症反应及降低组织氧化应激有关。关于HMP降低氧化应激的来源以及对SHR心脏形态学的影响尚需今后进一步的研究。【参考文献】1SAVOIAC,SCHIFFRINELINFLAMMATIONINHYPERTENSIONJCURROPINNEPHROLHYPERTENS,2006,1521522SUNL,GAOYH,TIANDK,ETOFDIFFERENTTISSUESINSPONTANEOUSLYHYPERTENSIVERATSJACTAPHYSIOLOGICASINICA,2006,5843183胡帼英麝香保心丸治疗缺血性心脏病心绞痛的临床疗效观察J中成药,2008,3023124张高峰,王受益,戴瑞鸿麝香保心丸对缺血再灌性损伤大鼠心肌的保护作用J中成药,1998,205295KATALINICV,MODUND,MUSICI,ETDIFFERENCESINANTIOXIDANTCAPACITYOFRATTISSUESDETERMINEDBY2,2AZINOBIS3ETHYIBENZOTHIAZOIINE6SULFONATEABTSANDFERRICREDUCINGANTIOXIDANTPOWERFRAPASSAYSJCOMPBIOCHEMPHYSIOLCTOXICOLPHARMACO1,2005,14047精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创13/146OUB,HUANGD,HAMPSCHWM,ETOFANTIOXIDANTACTIVITIESOFCOMMONVEGETABLESEMPLOYINGOXYGENRADICALABSORBANCECAPACITYORACANDFERRICREDUCINGANTIOXIDANTPOWERFRAPASSAYSACOMPARATIVESTUDYJJAGRICFOODCHEM,2002,501131227NAKASHIMAY,RAINESEW,PLUMPAS,BRESLOWJL,ETOFVCAM1ANDICAM1ATATHEROSCLEROSISPRONESITESONTHEENDOTHELIUMINTHEAPOEDEFICIENTMOUSEJARTERIOSCLERTHROMBVASCBIOL,1998,188428YOKOYAMAT,NAKANOM,BEDNARCZYKJL,ETPROVOKESAHYPERTROPHICGROWTHRESPONSEINCARDIOMYOCYTESJCIRCU