【精品实用】生物化学实验指导书

生物化学实验指导书 适用专业：生物技术、生物工程、食品科学与工程 生物与食品工程学院生物科学系 1 生物化学实验细则 为了保证生物化学实验的顺利进行，培养同学们掌握良好、规范的生物化学基本实验技能，特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。 1. 实验前应提前预习 实验指导书 并复习相关知识。 2. 严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。非本实验组的同学不准进入实验室。 3. 进入实验室必须穿实验服。各位同学进入各自实验小组实验台后，保持安静，不得大声喧哗和嬉戏，不得无故离开本实 验台随便走动。绝对禁止用实验仪器或药物开玩笑。 4. 实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。 5. 实验中要注意节约药品与试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方法，使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。 6. 使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。 7. 做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。 8. 实验后，要及时完成实验报告。 2006 年 1 月 2 目 录 生物化学实验细则 1 目 录 2 实验 1 蛋白质的沉淀、变性反应 3 实验 2 醋酸纤维素薄膜电泳分离 血清蛋白 6 实验 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 11 实验 4 凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 16 实验 5 琼脂糖凝胶电泳 20 实验 6 唾液淀粉酶的性质和活力测定 24 实验 7 生物氧化与电子传递 25 实验 8 植物体内的转氨基作用 27 3 实验 1 蛋白质的沉淀、变性反应 （ 3 学时 ） 目的要求 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3. 了解蛋白质变性与沉淀的关系。 原 理 在水溶液中，蛋白质分子表面形成 水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型： 1可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构 并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应。 如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时 间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。 2不可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 试剂和器材 一、试剂 1. 蛋白质溶液： 10 取 5或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至 100拌均匀后用 4 8 层纱布过滤，新鲜配置。 2. 蛋白质氯化钠溶液： 3 取 20清，加蒸馏水 200饱和氯化钠溶液 100分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。 3. 其余试剂： 硫酸铵粉末（ 10 克 /组），饱和硫酸铵溶液 (150 3%硝酸银（ 280 酸铅（ 200浓硫酸（ 5）， 5%磺基水杨酸（ 100 酸铜（ 100饱和硫酸铜溶液（ 400酸（ 500 10%乙酸（ 500饱和氯化钠溶液（ 25 10%氢氧化钠溶液（ 500 二、器材 试管（ 15 支 /组），过滤漏斗（ 1 个），试管架 1 个 /组，玻璃棒 1 支 /组，沸水浴 4 台，量筒 4 （总需要 201,2001），烧杯（总需要 1002， 400 2），试剂瓶（ 12 个 /组，附胶头滴管 10 支 /组），移液管（ 56/组， 13/组），滤纸 1 盒，洗瓶 1 个 /组，废液缸 1 个 /组，药匙 1 个 /组，移液管架 1 个 /组 操作方法 一、蛋白质的可逆沉淀反应 蛋白质 的盐析作用 (分级盐析 ) 3 m l 饱和硫酸铵过滤 滤液球蛋白沉淀硫酸铵粉末搅拌至饱和静置混匀静置1 0 m i n3 m l 蛋白质氯化钠溶液 滤液清蛋白沉淀弃去清液水 观察现象二、蛋白质的不可逆沉淀反应 1. 重金属沉淀蛋白质 2. 酸沉淀蛋白质 1） 2） 1 0 滴浓硫酸6 滴蛋白质溶液 观察两液界面不要摇动摇动试管观察现象3. 加热沉淀蛋白质 取 5 支试管，编号，按下表加入有关试剂（单位 /滴）。 蛋白质溶液 酸 10%乙酸 饱和氯化钠 10%氢氧化钠 蒸馏水 1 2 3 4 5 10 10 10 10 10 5 5 5 2 2 7 2 2 5 试 剂 管 号 5 将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热 10较各管的沉淀情况。 思 考 题 1. 名词解释：水化层；双电层；蛋白质变性；盐溶与盐析 ；蛋白质等电点沉淀。 2. 将实验结果 写在实验报告中操作方法的对应位置上并就实验现象作简要解释。 3. 根据实验现象，讨论下列问题： 1） 蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？ 2） 简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。 4. 作为杀菌剂，氯化汞是怎样起作用的？ 6 实验 2 醋酸纤维素薄膜电泳 分离血清蛋白 （ 4 学时） 目的要求 1. 学习蛋白质电泳的一般原理及方法。 2. 掌握用醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质的操作技术 。 原 理 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。带电颗粒之所以能在电场中向一定的方向移动，并具有一定的迁移速度，是取决于带电颗粒本身性质的影响，以及电场强度、溶液的 、离子强度及电渗等因素的影响。蛋白质具有两性性质，在溶液中可解离的基团除肽链末端的 氨基和 羧基外，还有很多侧链基团在一定的 件下能解离而使蛋白质带电。当溶液的 pH电点）时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，而的 pH，则带正电荷，电泳时向负极移动。 由于蛋白质分子在溶液中解离成带电的颗粒，所以在电场中除等电点外均能定向泳动，其电泳的方向和速度主要决定于所带电荷的性质， 以及所带电荷数 量、颗粒大小和形状。不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用迁移率来表示。迁移率的定义是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。其计算公式如下： 式中： m 为迁移率（ s） ； v 为颗粒的泳动速度（ cm/s）； E 为电场强度（ V/；为颗粒泳动的距离 （ ； 为支持物的有效长度（ ； V 为实际电压 （ V） ； t 为电泳时间 （ s）。 各种蛋白质的等电点、分子量及颗粒大小各不相同，在某一指定的 溶液中，各种蛋白质所带的电荷不同，因而在电场中迁移的方向和速度不同。根据这个原理，就可以从 蛋白质混合物中将各种蛋白质分离出来。因此，电泳技术在生物化学与分子生物学研究中被广泛用于生物大分子或小分子（如蛋白质、核酸、氨基酸等）的 分离纯化与分析鉴定等。同时此项技术也普遍用于临床诊断和工农业生产实践中，并已发展成为这些部门的重要分析分离手段。 醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持物的一种区带电泳。这种薄膜具有均一的泡沫状结构，厚度为 120 m，渗透性强，对样品无吸附作用，用它作支持物进行电泳，电泳效果比纸电泳好，具有样品用量少，分离速度快 ，电泳图谱更为清晰，灵敏度也较高（ 5 g / 等优点。目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定等方面。 本实验以醋酸纤维素 薄膜 为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、 种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同 （如图 2， 在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱 性 冲体系中、带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如，缓冲体系中电泳 1h 左右，染色后可显示 5 条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为 1， 2， 球蛋白（如图 2。 这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动 绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。 7 蛋白质名称 等电点（ 分子量 清蛋白 9000 1 20000 150000 156000 300000 图 2 人血清中 5 种蛋白质的等电点及分子量 图 2 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1 为清蛋白（或称为白蛋白）， 2、 3、 4、 5 分别为 1-、 2-、 球蛋白， 6 为点样原点 试剂和器材 一、测试材料 未溶血的人或动物血清。 二、试剂 巴比妥钠缓冲液（ ，离子强度 称取 比妥（ 比妥 钠（ 置于三角烧瓶中，加蒸馏水约 600加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至 1000 4保存，备用。 2. 染色液（ 基黑 10B）： 称取 基黑 10B，加蒸馏水 40醇（ 50乙酸（ 10匀溶解后置具塞试剂瓶内贮存。 3. 漂洗液： 取 95%乙醇（ 45乙酸（ 5蒸馏水 50匀置具塞试剂瓶内贮存。 4. 透明液：临用前制备。 甲液：取冰乙酸（ 15水乙醇（ 85匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液：取冰 乙酸（ 25水乙醇（ 75匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 5. 保存液：液体石蜡。 6. 定量洗脱液（ 液）： 称取 16g 氢氧化钠（ 少量蒸馏水溶解后定容至 1000 三、器材 醋酸纤维素薄膜（ 2 8培养皿（直径 9 10解剖镊子，点样器，直尺和铅笔，电泳仪及电泳槽，玻璃板（ 12 12试管及试管架，吸量管（ 25吹风机，普通滤纸。 8 操作方法 一、薄膜与仪器的准备 1. 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 用镊子取一片薄膜 ，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在 15 30条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜不均匀应弃去，以免影响电泳结果。将选好的薄膜用镊子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约 30，方可用于电泳。 2. 电泳槽的准备 根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两各膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端侵入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃 棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。 3. 电极槽的平衡 用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡 15 20意，取出平衡装置时应将活塞关紧。 二、 点样 1. 制备点样模板 取一张干净滤纸（ 10 10在距纸边 用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。 2. 点样 用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间轻轻按压，吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底 边与模板底边对齐。点样区距阴极端 。点样时，先用玻片一端截面沾取一定量的血清，然后将沾有样品的玻片截面垂直地与纤维素薄膜点样区处轻轻接触，样品即呈一条线“印”在薄膜上，（如图 2血清完全渗透至薄膜内，形成细窄而均匀的直线。 此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。 图 2酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图 虚线处为点样位置 三、 电泳 用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上，如图所示。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷 直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡 10 9 图 2泳装置剖视示意图 . 醋酸纤维素薄膜 用导线将电泳槽的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为 8 片薄膜则为 4.8 通电10 15，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为 8 片共 8电泳时间约50 80泳后调节旋扭使电流为 零，关闭电泳仪切断电源。 四、 染色与漂洗 1. 血清蛋白染色与漂洗脱色 用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含 基黑 10B 染色液的培养皿中，浸染 5出后再用漂洗液浸洗、脱色，每隔 10漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干。 五、透明 将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中 2即放入透明乙液中浸泡 1出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡。约 2 3膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次，垂 直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡 3用滤纸吸干液体石蜡，压平。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。 注 意 事 项 1 醋酸纤维素薄膜的预处理 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄均匀，如漂浮 15 30s 时，膜片吸水不均匀，则有 白色斑点或条纹，这提示膜片厚薄不均匀，应弃去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界限不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维素薄膜亲水性比纸小，浸泡 30使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸干的程度以不干不湿为宜。为防止指纹污染，取膜 时，应戴指套或用夹子。 2 缓冲液的选择 醋酸纤维素薄膜电泳常选用 比妥缓冲液，其浓度为 。选择何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。在选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽电极之间的膜长 10 度为 8 10需电压 25V/长，电流强度为 宽。当电泳时达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。 3. 加样量 加样量的多少与电泳条件、样 品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品 5 L，约相当 5g 蛋白。血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过 1 L，相当于 60g 蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量应先作预实验加以选择。 点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将 薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。 4. 电量的选择 电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为 宽为宜。电流强度高，则热效应高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。 5. 染色液的选择 对纤维素薄膜电泳后应根据样品的特点加以选择。其原则是燃料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素薄膜溶解。 应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间太短，着色浅不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。 6. 透明及保存 透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发而影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。 透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液体石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易展平。 思 考 题 1. 名词解释：区带电泳；电渗现象 ；电泳迁移率 2通 过本次实验，讨论下列问题： （ 1） 简述醋酸纤维薄膜电泳原理。 （ 2） 根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计它们在 巴比妥 巴比妥钠电极缓冲液中，移动的相对位置。 （ 3）醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有哪些优点？ 11 实验 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 （ 4 学时） 目的要求 1学习 定蛋白质分子量的原理。 2掌握 定蛋白质分子量的操作方法。 原 理 聚丙烯酰胺凝胶 是由单体 丙烯酰胺（ 称 交联剂 N,称 加速剂和催化剂的作用下聚合 而成的高分子物质 ，具有三维网状结构和分子筛性质。 以此凝胶 为支持物的电泳 称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 简称 由于各种蛋白质所带的净电荷、分子量大小和形状不同，在电泳中会产生不同的电荷效应和分子筛效应，不连续电泳还有浓缩效应，因而有不同的迁移率。 聚丙烯酰胺凝胶由于富含酰胺基，故它是稳定的亲水凝胶。结构中不带电荷，因而在电场中电泳电渗现象极为微小。网状结构能限制蛋白质大分子的扩散运动，具有良好的抗对流作用。在合适浓度范围内还具有较好的透明度，一定的机械强度，以及化学上惰性、吸附作用很小等许多优点。 十二烷基硫酸钠（简称 阴离子表面活性剂，它在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在。单体 与蛋白质结合生成蛋白质 合物。由于 有大量负电荷，所以生成的蛋白质 合物所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质所带净电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，。在蛋白质溶液中， 加入 巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽组分分成单个亚单位， 使蛋白质亚单位中的氢键、疏水键打开，因此 蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变，蛋白质 合物形状近似雪茄形的长椭圆棒，不同复合物的短轴相同，约 长轴改变则与蛋白质的分子量成正比。基于上述两种情况，蛋白质 合物在凝胶电泳中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是与椭圆棒的长度有关，也就是只与蛋白质分子量有关。在电泳体系中加入十二烷基硫酸钠（简称 则电泳迁移率主要依赖于蛋白质 分子量，而与所带的净电荷和形状无关，这种电泳方法称为 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 。 蛋白质分子量在 10， 000 200， 000 之间时 ，电泳迁移率 与 分子量的对数呈线性关系，可用下列公式表示： r 上式中， 蛋白质分子量； K 为常数； b 为斜率； m 为 相对 迁移率 （即蛋白质的电泳迁移 距离 除以示踪染料迁移距离 ） 。 根据上述方程将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图，可制作出一条标准曲线。在相同条件下只要测得未知分子量的蛋白质的电泳迁移率 ， 即可从标准曲线求得其近似分子量。 12 不同的凝胶浓度适用于不同的分子量范围（见表 3可根据所测分子量的范围选择最适凝聚浓度，并尽可能选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白。 凝胶浓度 交联度 分子量范围 5% 25,000 200,000 10% 10,000 70,000 15% 10,000 50,000 表 3分子量范围与凝胶浓度的关系 由于 有设备简单、快速，分辨率和灵敏度高等优点，广泛应用于生物化学、分子生物学、基因工程、医学及免疫学等方面。 为一种测定蛋白质分子量的方法，尽管对于大 部分蛋白质来说，在比较广泛的分子量范围内，蛋白质的迁移率与其分子量的对数确实存在着线性关系 ，但是有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质， 定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。为此，对这类样品分子量的测定，还必须采用其他测定方法作参照。 当然这也使得 别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定。 另外，还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质（如组蛋白 含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白（如胶原蛋白）等，它们在 凝胶系统 中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了测得真实和完整的蛋白质分子量，通常可采用多种方法进行测定和相互验证。 试剂与器材 一 、试剂 1. 标准蛋白质试剂盒（ 20 次 /支）：按使用说明配制 2. 胰蛋白酶 3. 连续体系 关试剂 1） 酸盐缓冲液： 称 于重蒸水中并定容 1L。 2) 样品溶解液 （上样液） ： 10 酸盐缓冲液，内含 1%1%巯基乙醇、 10%甘油和 酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。配制方法见 表 3 基乙醇 甘油 溴酚蓝 酸盐缓冲液 加重蒸水至最后总体积为 1000 3连续体系样品溶解液 3) 凝胶贮液： 称 重蒸水至 100滤后置棕色瓶内， 4贮存可用 1 2 个月。 4) 凝胶缓冲液： 6 称 酸盐缓冲液至 1004贮存，用前稍加温使 解。 13 5) 1% 取 重蒸水至 100棕色瓶内 4贮存。 6) 10%过硫酸铵（ 1 称 重蒸水 100棕色瓶内 4贮存。 7) 电极缓冲液（ 酸盐缓冲液）： 称 ，加 酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至 1L。 8) 2%琼脂（糖）粉： 20 称琼脂（糖） 2g，加 100述电极缓冲液， 4贮存。 4. 固定液： 取 50%甲醇 454乙酸 46匀。 5. 染色液： 考马斯亮蓝 上述固定液 250滤后应用。 6. 脱色 液： 冰乙酸 75醇 50蒸馏水定容至 1L。 二、器材 夹心式垂直板电泳槽（附带凝胶模 135 100 1 台 /组），直流稳压电源（电压 300 600V，电流 50 100移液管（ 12/组， 51/组， 102/组），烧杯（ 50），细长头的滴管 1 只 /组， 1射器，微量注射器（ 10 或 50 L），大培养皿（ 1201601/组），不锈钢药铲 1 个 /组，大烧杯（盛放废液） 2 个 /组，洗瓶 2 个 /组（分别盛重蒸水、蒸馏水），滤纸一盒，细铜丝（ 2 小段 /组），移 液管架 1 个 /组 操作方法 一、安装夹心式垂直板电泳槽 夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由 1 个 凵 形硅胶框、长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成。电泳槽由上贮槽（白金电极在上或面对短玻璃板），下贮槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部分按下列顺序组装： 1） 装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 2） 将长、短玻璃板分别插到 凵 形硅胶框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 3） 将已插好玻璃板 的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 4） 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 5） 竖直电泳槽，用细长头滴管吸取已熔化的 2%琼脂（糖）加在长玻璃板下端与硅胶框交界的缝隙内，其目的是封住空隙，加琼脂（糖）溶液时中应避免有气泡。 二、配胶及凝胶板的制备 1. 配胶 根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。表 3示配制 20同浓度分离胶所需各种试剂用量（单位 / 14 5% 10% 凝胶贮液 30%蒸馏水 0% 320同浓度分离胶各试剂用量 2. 凝胶板的制备 按表配制 20度的胶，将分离胶混合液直接倒入两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘 ，插入样品槽模板。凝胶聚合约需 3020 30，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去 残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可准备加样。 三、加样 加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为 10 15 L。如果样品槽中有气泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。 四、电泳 上槽接负极，下槽接正极，打开电源，将电流调至 20样品进入分离胶后，将电流调至 60染料前沿迁移至距硅胶框底边 1 ，停止电泳。 五、凝胶板剥离 电泳结束后，取下凝胶模，卸 下硅胶框，用不锈钢药铲撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为前沿标记。在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。 六、染色与脱色 先用固定液将凝胶固定 1 小时，再将染色液倒入培养皿内，染色 40右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 七、绘制标准曲线 将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（ 即染料迁移距离）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（ 即样品迁移距离），如图所示。按下式计算相对迁移率 染料迁移距离 样品迁移距离相对迁移率 以标准蛋白质的分子量为纵坐标，对应的相对迁移率为横坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线，根 据待测 样品相对迁移率可直接在标准曲线上查出其分子量。 凝 胶 浓 度 试 剂 15 图 3样品及标准蛋白在连续 离示意图 样品槽 1,2,4,5,为待测样品，样品槽 3 为标准蛋白 思 考 题 1. 名词解释： 聚丙烯酰胺凝胶电泳中浓缩效应、电荷效应、分子筛效应； 2. 根据实验结果绘出标准蛋白质的标准曲线 ，并计算出待测蛋白的分子量。 3. 通过本次实验学习，讨论下列问题： 1） 于蛋 白质分子量测定的基础是什么？ 2）对于由多条肽链组成的蛋白质， 否测定出它的分子量，如何测定出？ 16 实验 4 葡聚糖 凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 (4 学时 ) 目的要求 1. 初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。 2. 学习用标准蛋白质混合液制作 “选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。 原 理 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。目前关于凝胶层析的原理有许多假设和理论，普遍 接受的是分子筛效应。凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸液膨胀，然后装入层析柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。对凝胶层析分离的简单过程可用图 4示。 小分子大分子凝胶颗粒图 4分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留， 大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。 当凝胶装柱后，柱床容积为“总容积” 由 i,部分组成 : 0式中 外容积，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积，相应于一般层析法中柱内流动相的容积； 内容积，即凝胶颗粒内部所含水相容积，相应于一般层析法中的固定相容积； 凝胶本身的容积。 洗脱容积 自加入样品时算起，到组分最大浓度峰出现时所流出的容积，它与 i 的关系为： 0式中 分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系 数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒空隙的大小分布有关。上式可改写成： 17 有效分配系数，对交联度小的凝胶 别较小，而对交联度大的凝胶二者差别较大。 用下式表示： 00根据凝胶层析原理，对同一类型化合物的特征与组分的分子量有关。流过凝胶柱时，按分子大小顺序流出，分子量大的走在前面。洗脱容积 该物质分子量对数的线性函数： 式中， 21,常数， 分子量。 效分配系数）代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以为“选择曲线”。如图 4示。选择曲线的斜率说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线愈陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要决定于溶质分子量大小，每一 类型的化合物如球蛋白类等都有自己特殊的选择曲线，可用于测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线部分为宜。 图 4蛋白分子量选择曲线 为了测定分子量，就必须知道一根特定柱的 而计算出 用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约 200 万的蓝色葡聚糖 2000 等有颜色的溶液，通过测定大分子物质的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积就是该柱的 。选一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积 去 i，常用硫酸铵来测定。 用下式计算： 2 为常数 D 为柱直径， h 为凝胶床的高度。 18 试剂和器材 一、试剂 1. 蛋白质样品（采用氯化高铁血红素溶液 8mg/ 2 2. 标准蛋白质混合液： 2 3mg/色葡聚糖， 8mg/红蛋白， 剂为含 15%（ V/V）甘油的洗脱缓冲液。 3. 蓝色 葡聚糖 2000（ 2mg/ 2 4. 硫酸铵（ 1 2mg/ 2 5. 洗脱液 盐酸溶液 (内含 50 液与 盐酸混匀后，溶解 水稀释至100得洗脱液 6. . 5%c)2 二、器材 层析柱：柱管（直径 长 901001 个 /组，试管（ 30 支 /组），玻璃棒 1 个 /组，滤纸一盒，移液管（ 12）， 721 分光光度计、脱脂棉、试管架 1 个 /组、铁架台 1 个 /组 操作方法 一、一般操作方法 1. 凝胶的处理（教师准备） 将称好的干粉倾入过量的洗脱液中，在室温下放置，使之充分溶胀。为了缩短时间，可在沸水浴中加热将近 100，这样可缩短溶胀时间至几小时，而且可以杀死细菌和霉菌，并排除凝胶内气泡。 2. 装柱 装柱前将凝胶上面过多的溶液倾出，用真空干燥器抽尽凝胶中空气。关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约 1/3 柱容积的洗脱液，然后在缓慢搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然 沉降，待凝胶沉降约 2 3，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约 5时停止装柱，关闭出水口。接着通过 2 3 倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一张滤纸片或一团脱脂棉，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。 3. 加样 加紧上、下进出水口夹子，以防止操作压改变。用 1液管吸取1品混合液，将移液管尖端小心插入柱中液面下方 1，小心释放样品，使其在脱脂棉上端形成一个层面，过程大约需要 2 分钟完成。看到样品层刚好完全流入凝胶 床时，向柱上小心的添加缓冲液至合适高度（约 5右），以保证流速的稳定。（注意：不能使胶床上端无充裕的缓冲液，以防干裂） 4. 洗脱 洗脱时，打开上、下进出口夹子，先收集 10出液，用洗脱液以每管 4流速洗脱， 19 用试管收集流出液，并对每管编号。当所有有色物质洗脱下来后，关闭螺旋夹停止洗脱。然后在对应的波长下读各管的光吸收值。 二、蛋白质分子量的测定 1. 测定 色葡聚糖 2000 和硫酸铵混合液（ 2mg/柱、洗脱，分别测出蓝色葡聚糖的洗脱体积 为该柱的 酸铵 的洗脱体积 为该柱的 色葡聚糖的洗脱峰可根据颜色判断，硫酸铵的洗脱峰用 c)2 判断。 2. 标准曲线的制作 按上述方法将 1准蛋白质混合液上柱、洗脱，用试管收集。 收集后，于以下对应波长下读各管的光吸收值： 蓝色葡聚糖（蓝色）： 650红蛋白（琥珀色）： 500色）： 440洗脱体积为横坐标，光吸收值为纵坐标作洗脱曲线。根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积（ 然后以蛋白质分子量的对数 纵坐标， 横坐标，作出标准曲线。同时根据已测出的 及计算出的 出 可以 横坐标， 纵坐标作出标准曲线。 3. 未知样品分子量的测定 将未知样品按标准曲线的条件操作。根据洗脱峰的位置，量出洗脱体积，也可以计算出 别由标准曲线查得样品的分子量。 思 考 题 1. 根据实验中遇到的各种问题，概述做好本实验的经验与 教训 。 2. 凝胶过滤的介质有 哪 些，各过滤介质的异同是什么？ 3. 通过本次实验学习，讨论 凝胶过滤法测定蛋白质分子量的异同。 20 实验 5 琼脂糖凝胶电泳 （ 4 学时） 目的要求 1. 掌握琼脂糖凝胶 电泳分离 原理和方法。 2. 学习利用琼脂糖电泳方法测定 段大小。 3. 学习有关建立 制性内切酶图谱的基本技术。 原 理 子在碱性环境中（ 冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的 段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭染色，在波长 254外光照射下， 橙红色荧光。 琼脂糖凝胶电泳对 分离作用主要依据 分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。一定大小的 段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离 段大小范围见表 1。因而要有效分离大小不同的 要是选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同构型的 琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的 动速度次序如下：共价闭环 线环的双链环状 同一浓度的凝胶中，分子量较小的 段比较大的片段快。 段的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。将未知 迁移距离与已知分子大小的 准物的电泳 迁移距离进行比较，即可计算出未知 段的大小。 琼脂糖凝胶浓度 /% 可分辨的线性 小范围 /0 5 0 1 0 5小范围与琼脂糖凝胶浓度的关系 本实验采用限制性内切酶 解 片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，以它们对应的迁移率为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘制出测定 子量的 标准曲线。共价闭环质粒 有一个 切位点，酶解后成为一条线状 过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型 迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小。 21 试剂和器材 一、试剂 1. 限制性内切酶 试剂盒 2. 标准 使用说明配制 3. 标准 使用说明配制 4. 酶反应终止液（ 10 20%酚蓝）： 10 L/组 称取 220 克 溴酚蓝，溶解后定 容至 100 5. 电极缓冲液（ 5 用前稀释 10 倍 称取 硼酸， 2解后用蒸馏水定容至 200用前用蒸馏水稀释 10 倍，称为 释缓冲液（ 。 6. 溴乙锭（ 色贮存液（ 1mg/ 1 滴 /组 将 100乙锭溶于蒸馏水或电极缓冲液 100色瓶内封好，避光保存。 诱变剂，配制和使用时应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在地面或桌面上。 凡是沾污过 器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去 。 7. 1%琼脂糖 二、器材 心管（ 先高温高压灭 毒， 3 个 /组）及其离心管架，电泳槽（ 1 个 /组），电泳仪（ 1 个 /2 组），凝胶塑料托盘（ 1 个 /组），锥形瓶（ 1001，烘干），小烧杯（ 50， 100，250微量注射器（ 2 L 3