急性镉中毒的肝脏损伤机制及金属硫蛋白的保护作用

精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创1/13急性镉中毒的肝脏损伤机制及金属硫蛋白的保护作用MECHANISMOFLIVERINJURYINCADMIUMTOXICATIONANDPROTECTIONOFMETALLOTHIONEIN金慧英胡惠民周雍李法卿谭维国李素芹陈华标JINHUIYING,HUHUIMIN,ZHOUYOUNG,ETAL摘要目的研究脂质过氧化和自由基在急性镉中毒性肝脏损伤中的作用及金属硫蛋白（MT）的保护作用。方法测定镉染毒后不同时间大鼠肝脏的MT和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量及抗氧化酶的活力，观察肝细胞超微结构的损伤，进行自由基H2O2的定位。结果大鼠急性染镉后MDA高于对照组P抗氧化酶活力在3小时显著受抑P,6小时明显恢复；MT在3小时即有增加，6小时达正常组的倍肝细胞膜上H2O2的阳性沉积物3小时最严重，24小时已消失，但此时细胞损伤最严重，48小时肝细胞再生、修复。结论镉可引起肝脏脂质过氧化及自由基的大量产生，抑制抗氧化酶的活力，造成细胞的严重损伤。MT对肝脏抗氧化酶活力的恢复、脂质过氧化的减轻、自由基的清除及损伤的肝细胞的保护可能有重要作用。关键词急性镉中毒脂质过氧化金属硫蛋白大鼠肝脏MECHANISMOFLIVERINJURYINCADMIUMTOXICATIONANDPROTECTION精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创2/13OFMETALLOTHIONEINJINHUIYING,HUHUIMIN,ZHOUYOUNG,ETALINSTITUTEOFMILITARYMEDICINEOFNANJINGCOMMAND,NANJIN210002ABSTRACTTOSTUDYTHEMECHANISMOFLIVERINJURYBYLIPIDPEROXIDATIONANDFREERADICALANDTHEPROTECTIONOFMETALLOTHIONEINMTINACUTECADMIUMTOXICATION,THECONTENTSOFMTANDMALONYLDIALDEHYDEMDA,METABOLICPRODUCTOFLIPIDPEROXIDATION,ANDACTIVITIESOFANTIOXIDASESINCADMIUMEXPOSEDRATLIVERATDIFFERENTTIMEWERE,THEINJURYOFHEPATOCYTESANDFREERADICALH2O2LOCALIZATIONWEREALSOSTUDIEDBYELECTRONRESULTSSHOWEDTHATMDACONTENTWASINCREASEDPAFTERACUTECADMIUMEXPOSURE,THEACTIVITIESOFANTIOXIDASESSIGNIFICANTLYDECREASEDPAT3HANDPROGRESSIVELYRECOVEREDAT6精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创3/13WASINCREASEDAT3H,REACHINGTIMESASMUCHASTHATOFCONTROLAT6POSITIVEPRECIPITATIONONOUTERPLASMAMEMBRANEOFHEPATOCYTESWASOBVIOUSLYINCREASEDAT3H,ANDDISAPPEAREDAT24HBUTHEPATOCYTEINJURYWASVERYSEVEREATTHISTIME,AT48HHEPATOCYTERECOVEREDTHROUGHISCONCLUDEDTHATACUTECADMIUMTOXICATIONWOULDCAUSELIPIDPEROXIDATIONANDEXCESSIVEFREERADICALPRODUCTION,ANDINHIBITTHEACTIVITIESOFANTIOXIDASESLEADINGTOSEVEREINJURYOFMAYHAVEIMPORTANTROLEINTHERECOVERYOFANTIOXIDASEACTIVITIESALLEVIATIONOFLIPIDPEROXIDATIONANDELIMINATIONOFFREERADICALS,ANDPROTECTIONFROMINJURYOFHEPATOCYTESKEYWORDSACUTECADMIUMTOXICATIONLIPIDPEROXIDATION精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创4/13METALLOTHIONEINRATLIVER金属硫蛋白METALLOTHIONEIN,MT是富含巯基的小分子蛋白质，对金属具有高亲合力。MT与急性镉中毒引起的脂质过氧化作用的一系列变化的关系尚未明确定论。为此，我们着重探讨脂质过氧化及自由基损伤、抗氧化防御系统和MT在急性镉中毒时的变化规律及其相互关系，为镉中毒的防治以及抗氧化剂MT的临床应用奠定基础。材料与方法一、材料1动物健康雄性SD大鼠，体重240300G，第二军医大学实验动物中心提供。2试剂和仪器胆酸钠公司，德国，二硫二硝基苯甲酸DTNB及还原型谷胱甘肽GSHFLUKA公司，德国，丙二醛MDAALDRICH公司，美国，其余试剂均为国产分析纯。HITACHI800透射电镜、HITACHIS8300原子吸收光谱仪、HITACHIHIMICCR21低温高速离心机日立公司，BIORAD3550酶标仪（美国），721分光光度仪上海第三分析仪器厂。二、方法1大鼠镉中毒模型的建立和分组健康SD大鼠56只随机分为7组，每组8只1组为正常对照组，6组为实验组。实验组按每公斤体重MG镉计尾静脉注射CDCL2，对照精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创5/13组注射生理盐水。于注射后、1、3、6、24、48小时取肝组织,加蔗糖溶液,匀浆，4、15000G离心30分钟，取上清测定超氧化物岐化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSHPX、过氧化氢酶CAT活力，取匀浆测定MDA含量。取1G肝组织测定MT含量。2各项指标的测定方法1镉浓度原子吸收光谱法。2MDATBA法1。3SOD活力邻苯三酚自氧化反应终止法2。4GSHPX活力催化GSH氧化法3。5CAT活力比色法4。6MT含量ELISA法5。7蛋白含量染料法。8细胞损伤及H2O2的电镜细胞化学定位CECL3法大鼠肝门静脉灌注1MMOL/L的CECL3平衡液，继而灌注戊二醛固定液，灌流压力保持在75MMHG。取肝组织切成1MM3小块，常规固定、脱水包埋、切片、铅铀染色，电镜观察。3统计学方法结果采用T检验比较组间的差异。结果急性染毒后大鼠肝脏各项指标的变化见表1。2电镜肝细胞损伤及H2O2的细胞化学定位（图18）依TRUMP1981的观点，将正常细胞从损伤到坏死的演变分为形态正常（第1阶段）、可逆性改变（24阶段）和不可逆改变（57阶段）期。计数每个网孔内各期细胞数并观精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创6/13察H2O2CECL3阳性沉淀,结果见表2。表1急性镉染毒后不同时间大鼠肝脏各项指标的变化S,N8TABLE1CHANGESOFTHELEVELSOFCD,MDA,SOD,GSHPX,CATANDMTINLIVEROFRATATDIFFERENTTIMEAFTERACUTECDADMINISTRATIONS,N8G/MGPROTMDANMOL/MGPROTSODU/MGPROTGSHPXU/GPROTCATK/MGPROTMTG/GLIVER染镉组CDEXPOSEDGROUPHHHHHH对照组CONTROL与对照组比较，P，PP,PVSCONTROL精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创7/13表2急性镉中毒大鼠肝细胞损伤及H2O2CECL3沉淀的电镜观察TABLE2HEPATOCYTESINJURYANDH2O2CECL3PRECIPICATIONBYELECTRONMICROSCOPYINRATSAFTERACUTECDTOXICATION染镉后时间TIMEAFTEREXPOSURETOCDH形态正常细胞数NORMALNO可逆改变细胞数REVERSIBLECHANGENO不可逆改变细胞数IRREVERSIBLECHANGENO细胞总数TOTALNOH2O2CECL3沉淀H2O2CECL3PRECIPITATION精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创8/1323231815335121532816244242825328图1正常肝细胞糖原颗粒聚集,粗面内质网ER丰富，线粒体嵴清晰10500图2染镉后30分钟肝细胞结构正常，未见CE的沉积10500图3染镉后1小时ER扩张，核糖体已大部脱落，线粒体轻度肿胀；可见少量CE呈点状沉积在肝实质细胞PC、内皮细胞EC膜上12000图4染镉后3小时ER极度扩张，线粒体膨胀，内外膜模糊不清；见大量CE沉积在PC、EC和KUPFFERS细胞K膜上15000图5染镉后6小时处于不可逆改变状态的肝细胞胞浆清亮，少有细胞器；仍可见少量CE沉积在PC和EC膜上5500图6染镉后24小时可见破碎的肝细胞，胞内膜结构大多精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创9/13已不清晰；未见CE的沉积7000FIG1NORMALHEPATOCYTEGLYCOGENPARTICLESAGGREGATED,MITOCHONDRIALCRISTAECLEAR,ENDOPLASMICRETICULUMERABUNDANT10500FIG230MINAFTERCDINJECTIONNOCHANGEOFHEPATOCYTESTRUCTUREANDNOCEH2O2PRECIPITATION10500FIG31HAFTERCDINJECTIONERDILATANT,RIBOSOMESMOSTLYDISLODGED,MITOCHONDRIASLIGHTLYSWOLLEN,SMALLAMOUNTOFCEH2O2PRECIPITATIONONTHEMEMBRANEOFLIVERPARENCHYMALCELLPCANDENDOTHELIALCELLEC12000FIG43HAFTERCDINJECTIONEREXTREMELYDILATANT,MITOCHONDRIASWOLLEN,ALOTOFCEH2O2PRECIPITATIONONTHEMEMBRANEOFPC,ECANDKUPFFERSCELLKC15000FIG56HAFTERCDINJECTIONINIRREVERSIBLESTATE,HEPATOCYTOPLASMCLEAR,精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创10/13FEWORGANELLE,AFEWCEH2O2PRECIPITATIONONTHEMEMBRANEOFPCANDEC5500FIG624HAFTERCDINJECTIONHEPATOCYTEPLASMOTORRHEXIS,MEMBRANEOFNUCLEUSANDMITOCHONDRIONNOTCLEAR,NOCEH2O2PRECIPITATION7000图7染镉后48小时核已固缩的PC和增生的成纤维细胞F，无CE的沉积5500FIG748HAFTERCDINJECTIONNOCEH2O2PRECIPITATION,PYKNOTICPCANDHYPERPLASTICFIBROBLASTF5500图8染镉后48小时正常形态的肝细胞无CE的沉积4200FIG848HAFTERCDINJECTIONNOCEH2O2PRECIPITATIONINNORMALHEPATOCYTES4200讨论以上结果表明大鼠尾静脉注射镉后，镉很快聚集在肝脏，肝脏是镉急性中毒损伤的主要靶器官。镉作为过渡金属可通过FENTON反应将H2O2转变为羟自由基，作用于质膜，造成膜的脂质过氧化。同时，镉直接与抗氧化酶中的金属相互作用，抑制酶的活力，使自由基的清除受到影响。自由基作用于不饱和脂肪酸，加重了膜的脂质过氧化，因精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创11/13而在镉中毒后MDA的含量均显著高于正常。脂质过氧化和自由基可造成细胞的结构和功能的改变，使细胞损伤进行性加重，是镉中毒损伤的主要因素6。金属硫蛋白是小分子可诱导蛋白，含有20个半胱氨酸残基，可被镉、汞、锌等二价金属诱导。由于镉的诱导，在染镉后3小时，已有MT的合成，MT与镉的亲和力升高，逐步增加细胞内结合镉的浓度，减少游离镉的浓度，使镉不能作用于其靶分子，从而减轻镉对抗氧化酶的抑制，加快自由基的清除，抑制脂质过氧化；同时MT富含巯基的特殊结构使其具有多种生物学功能，包括自由基特别是羟自由基的清除以及抑制膜的脂质过氧化7。所以，随着MT的合成增加，MDA含量的下降非常显著，肝细胞膜上的自由基2O2阳性沉积物也逐步减少，最终减轻了镉对肝细胞的损伤。肝细胞在染毒后24小时大量破碎,而48小时肝内正常细胞又占多数，肝血窦重新被内皮细胞包围，即MT对中毒剂量的镉引起的肝脏损伤有保护作用。总之，镉急性中毒后，自由基和脂质过氧化的产生和减少，肝细胞损伤的出现和修复，抗氧化酶SOD、GSHPX、CAT的活力下降和恢复及MT的诱导产生等,彼此之间有着密切的消长时相关系。因此,可以认为自由基和脂质过氧化是镉损伤的主要因素。同时在镉中毒后抗氧化酶和MT以协同作用的方式互相补充发挥了抗氧化的功能，减轻了精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创12/13细胞