DB22T 2015-2014 坏死梭杆菌检测PCR法

ICS11220B41备案号418092014DB22吉林省地方标准DB22/T20152014坏死梭杆菌检测PCR法DETERMINATIONOFFUSOBACTERIUMNECROPHORUMPOLYMERASECHAINREACTION20140228发布20140430实施吉林省质量技术监督局发布DB22/T20152014I前言本标准按照GB/T112009、GB/T2000142001给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出，吉林省畜牧业管理局归口。本标准起草单位中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人陈立志、冯二凯、王秀东、刘晓颖、姚志利、王峰、王雷、司方方、范琳琳、徐晶、姜英。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。DB22/T201520141坏死梭杆菌检测PCR法警告使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合管家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了坏死梭杆菌的聚合酶链反应（PCR）检测方法。本标准适用于反刍动物坏死梭杆菌的检测和分型。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法WS/T230临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。31坏死梭杆菌FUSOBACTERIUMNECROPHORUM一种严格厌氧的革兰氏阴性多形态的条件致病杆菌。32PCR聚合酶链反应POLYMERASECHAINREACTION体外酶促合成特异性DNA片段的一种分子生物学实验方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成即模板DNA先经高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与两条模板DNA链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核苷三磷酸（DNTPS）为底物，使退火引物得以延伸。如此反复，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。4缩略语DNA脱氧核糖核酸（DEOXYRIBONUCLEOSIDEAACID）。DNTP脱氧核苷三磷酸（DEOXYRIBONUCLEOSIDETRIPHOSBATE）。EDTA乙二胺四乙酸（ETHYLENEDIAMINETETRAACETICACID）。DB22/T2015201425原理针对坏死梭杆菌白细胞毒素两亚种启动子的特异性区域基因序列设计引物，应用聚合酶链反应（PCR）技术从临床疑似坏死杆菌病病料扩增特异性DNA片段，根据是否扩增特异性片断及片断大小对坏死梭杆菌进行检测和分型。6试剂与材料除非另有说明，所有的化学试剂均为分析纯。实验用水规格应符合GB/T6682中二级水的规定61试剂611引物上游引物P15GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC3上游引物P25GATCTTTGTTGGAAGCGAGT3下游引物P35GCACGACAAACCAAATAGC3配制成10MOL/L，20保存。612DNA分子量标准DL2000。613细菌基因组DNA提取试剂盒。614DNTP溶液，含DATP、DTTP、DCTP和DGTP，各25MNOL/L。615DNA聚合酶（5U/L）。61610PCRBUFFER（不含氯化镁）（市售）100MMOL/LKCL,160MMOL/LNH42SO4,20MMOL/LMGSO4,200MMOL/LTRISHCLPH88,1TRITONX100，1MG/MLBSA。617氯化镁（MGCL2）25MMOL/L。618琼脂糖，电泳级。1琼脂糖凝胶的配制琼脂糖1GTAE电泳缓冲液（50倍）2ML灭菌三蒸水98ML微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液5L。619TE缓冲液（1）10MMOL/LTRISHCL（PH80），1MMOL/LEDTA。6110溴化乙锭（10MG/ML）称量100MG溴化乙锭溶解于10ML水中，然后分装成1ML/份，4避光保存。611150TAE称量2420GTRIS溶于700ML蒸馏水中，加入571ML冰乙酸，100ML05MOL/LEDTA（PH80）后定容至1000ML，使用时50倍稀释。61126LOADINGBUFFER市售）含025溴酚蓝，025二甲苯青FF，30甘油水溶液，4保存。DB22/T20152014362材料621离心管15ML。622吸头1000L。623吸头200L。624吸头10L。625PCR反应管。626冰盒12孔4孔。7仪器设备71紫外分光光度计。72PCR仪。73电子天平（感量001G）。74紫外透射仪或凝胶成像系统。75离心机12000R/MIN。76核酸电泳仪。77涡旋振荡器。78微量可调移液器02L2L，2L20L，20L200L，100L1000L。79恒温水浴锅。710PH计8样品81采集用无菌棉拭子沾取疑似感染坏死梭杆菌的动物病灶的病健结合处的组织或脓汁，放入灭菌的冻存管中，低温冷藏保存（04）备用。82处理将采回病料使用200LTE悬浮，自然沉淀5MIN，2000R/MIN离心3MIN，4000R/MIN离心1MIN；吸取上清至另一灭菌EP管，12000R/MIN离心5MIN，弃上清；加200LTE重悬沉淀，12000R/MIN离心5MIN，弃上清，洗三次；沉淀加200LTE重悬。83提取模版DNA按照细菌基因组试剂盒说明书提取坏死梭杆菌基因组DNA。84阳性与阴性对照841阳性对照坏死梭杆菌NECROPHORUM亚种（ATCC27852）基因组DNA；坏死梭杆菌FUNDULIFORME亚种（ATCC51357）基因组DNA；按照基因组试剂盒说明书分别提取坏死梭杆菌NECROPHORUM亚种（ATCC27852）和坏死梭杆菌FUNDULIFORME亚种（ATCC51357）基因组DNA。842隐性对照灭菌水DB22/T2015201449检测91PCR反应体系表1PCR反应体系单位为微升成分COMPONENT用量DOSAGEDNTP/（25MMEACH）2010PCRBUFFER/（MG2阴性）25引物L7/10MM10引物L8/10MM10引物L9/10MM10MG2/（25MM）35DNA模版20TAQ酶/（5U/L）02灭菌双蒸水定容至250注按照上述试剂顺序逐项加样至已编好号的02ML的PCR反应管中比，混匀后瞬离92PCR反应程序921预变性95，10MIN。922循环扩增941MIN，5650S，721MIN，30个循环。923延伸72，10MIN。4保存。93扩增产物电泳用TAE电泳缓冲液配制成1琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度05G/ML）。将平板放入水平电泳槽中，加入1TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物6L与6L上样缓冲液混合，分别加入样品孔中，取5LDNAMARKERDL2000加入到标准分子量对照孔内。5V/CM恒压电泳30MIN45MIN。10结果判定DB22/T201520145用凝胶成像系统进行分析。在阴性和阳性对照成立情况下，若待检样品出现1076BP特异性片段，即判定为FNN亚型；出现809BP特异性片段，即为FNF亚型。必要时取PCR扩增产物进行测序，如果结果与附录A参考序列比较，序列相似性在95以上，可进一步确认待测样品结果为阳性（标准序列见附录A1、A2）。11废弃物处理和防止污染的措施。111检测过程中的废弃物进行无害化处理。112检测过程中防止交叉污染的措施按照WS/T230中污染的预防和控制规定执行。DB22/T201520146附录A（资料性附录）坏死梭杆菌亚型判定的特征性序列A1坏死梭杆菌FNN型白细胞毒素启动子区扩增片段序列GCTTTCCTGCTTGTTTATTTCTCATGATCTTTTTGTTGTTCGAAATATTTGCGATAGAGTTTTGATTATGAAAGAAGGGAAAATCATAGAAGAAGGAAAGAAAGAGGAAATCTTTAAAGCACCGAAAAAAGAGTATACTCAATTTTTGCTGGAAGTGAGTATGAGTTTTATATTTTGATATAAAATCGAATAAAAAGGTATTTTTTTGAAGAAAGGAAGCTTATCTTAACATAGATTTAACATTTGATGTGATAGCATGAATTTAATATAAAATGCTGAAAATGTATCTAAAAATAATATAAAAAGAACATTGTATTTCCATAAAAAAATATTTTTTTAAATAAATATTTTATATAAAAAAATAATTAAATTTAAACTAGACATACAATAAGAAATATGCTAATCTAATAACGCTTGATATTTTAAAAAAATTAAAAATCATGAATACAATAGATGTTTATATCATTTGAGCTTCTTTTTTGAAAAACAGGAATTGTATTTTAATATAAAAAAATACTTCTTAAGATGAATATTTTATATAAAAAAATAATTAAATTCGAACTAGACATATGATAAGAAATATGCTAGTCTAATAACAGTTGATATTTTAAAAAAATTAAAAATTCATAAAAAATAAAATTGGGAGAAATTATGTTTCATTTAAAAAAAGAATTAAAAACATTTGTTTTTTTTATGTTGATTTTAAGTTGCCCAAATATATTGGCAGAAGGAATTCAAACATCCTCTACAGAATCGGATGCTGGAATGCTACTTGATAGAAACAACAGGATATTTCAACAAGGAAAATTACAGAAGATTTTGCATTCTGAGAAAGAAAAACGAAAACAAGGAATTGAAAATTTGGAGAAGAAAAAGGAAGAAGATATCAAAGTATCAGATGTTTCTTTTTTATTAAAAAAATTGGAGATTCCAAAGTCTGATATTTTAACAGAAGAAGAAATCGTAAGGATTTGGGAGCCCTATATAGAAAAAGAAGTTACCGTTGCAGATCTTTATACTATAGTTCAAAAAATCAATGAATTATATCAGGAAAAAGGCTATTTGGTTTGTCGTGCAA2坏死梭杆菌FNF亚型白细胞毒素启动子区扩增目标序列CAATTTTTGTTGGAAGCGAGTATACAATTTTTGTATGAAAAAGATAAAAAGAGAATATAAATTTTGGCTGTTTAAATTTTTTAAACAGCTTTTTTATTTTTGGAATAAAAAAATTAGGAAAGTATATCAAAAAATGAAAAAGAAACCATAAAAATAAAAAAACAAAAAATAATTGTTTTATTTTCGATAAATAAGAAAAAATAGGTATTTTATAATTTTTAAAAAATTAAAATGTTCTGAAATTATAAAAATATTTCTTAAAACGAATATTTTATATAGAAATACGTTCAAATTCAAGCTAGACATATTGTGAGAAATATGTTATTTTGATAATGGCTGTTATTTAATAAAAATTAAAAATTCATGAAAAATAAAATTAGGAGAAATTATGTTTCAGTTAAAGAAAGCTTTGAAAATACTTCTTTTTTTATCGATATTCAATAGCTCAAGTGTTTTTGCAGAAGAAGTCGGAATATTATCTACAGAATTGGATTCCGGAATATTAACAGATAGAAATAATAAAATATTCCAACAAGAAAAATTACAAAGAAC