DB22T 2600-2016 梅花鹿、马鹿茸片鉴别方法PCR法VIP

ICS67120B45备案号542712017DB22吉林省地方标准DB22/T26002016梅花鹿、马鹿茸片鉴别方法PCR法IDENTIFICATIONOFSIKADEERANDWAPITIVELVETSLICESPOLYMERASECHAINREACTIONMETHOD20161222发布20170401实施吉林省质量技术监督局发布DB22/T26002016I前言本标准按照GB/T112009和GB/T2000142015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人杨颖、邢秀梅、荣敏、刘敏、武薇、吴琼、徐超、徐佳萍、涂剑锋、刘汇涛、刘华淼。DB22/T260020161梅花鹿、马鹿茸片鉴定方法PCR法1范围本标准规定了梅花鹿、马鹿茸片的PCR鉴定方法的原理、试剂或材料、仪器设备、试验步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施。本标准适用于梅花鹿、马鹿茸片产品的真伪鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件31鹿茸片DEERVELVETSLICES为梅花鹿和马鹿的商品茸利用特制的切具切制的薄片。4原理利用梅花鹿、马鹿线粒体DNA（MTDNA）的DLOOP区特异性基因序列设计引物，应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增特异性DNA片段，依据是否扩增出特异性片段对鹿茸片进行鉴定。5试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。51水，GB/T6882，一级。52十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。53三羟甲基氨基甲烷（TRIS）。54乙二胺四乙酸二钠EDTA。55十二烷基硫酸钠（SDS）。56氯化钠。57三氯甲烷。58异丙醇。59无水乙醇。DB22/T26002016251070乙醇。511CTAB提取缓冲液20G/LCTAB,14MOL/LNACL,01MOL/LTRISHCL,002MOL/LNA2EDTA,PH80。512CTAB沉淀液5G/LCTAB，40MMOL/LNACL。513蛋白酶K溶液（20MG/ML）。514NACL溶液（12MOL/L）。515TE缓冲液（TRISCL、EDTA缓冲液）10MMOL/LTRISHCL（PH80）,1MMOL/LEDTA（PH80）。516引物DF5，CAAAGCACGTGATATAACCTTATG3，DR5，CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA3，6仪器设备61PCR仪。62紫外分光光度计或核酸蛋白分析仪。63电泳仪。64凝胶成像系统。65电子天平感量00001G。66离心机离心力12000RPM。67涡旋振荡器。68恒温水浴锅。69研钵或粉碎装置。610微量移液器05L10L，10L100L，20L200L，200L1000L。7试验步骤71样品制备将样品用研钵或粉碎装置研磨成粉末状即可。72DNA提取721将样品研磨后，称取200MG左右样品于2ML离心管中，加入15MLCTAB提取缓冲液和40L蛋白酶K溶液。72260震荡过夜后13000G离心10MIN，转移上清液到新的离心管中。723加入750L三氯甲烷后用力震荡，13000G离心5MIN，将上清液转移到新的离心管中。724加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，室温静置60MIN，13000G离心15MIN，弃去上清液。725加入350LNACL溶液将沉淀进行悬浮。再加入350L三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13000G离心10MIN。726转移上清液后加入06倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20MIN，13000G离心10MIN，弃去上清液。727加入500L75乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200L超纯水中。立即使用或20保存备用。728也可用等效的DNA提取方法提取模板DNA。73DNA质量的测定DB22/T260020163使用紫外分光光度计或核酸蛋白分析仪，分别测定260NM和280NM处吸光值（OD）为A260和A280，DNA浓度按公式（1）计算。当A260/A280比值在1618之间，适宜PCR扩增。100050NAC1式中CDNA浓度，为微克每微升（G/L）；A260NM处的吸光值；N核酸稀释倍数。74PCR反应体系PCR反应体系见表1，同时设置阴性对照（超纯水）。表1PCR反应体系（15L）反应试剂反应体积LDDH2O9310BUFFER15DNTPS20引物各05TAQ酶02DNA模板1075PCR反应程序预变性94C，5MIN；循环扩增94C，30S，56C/30S，67C，1MIN，30个循环；延伸67C，5MIN。76PCR扩增产物电泳用1TAE电泳缓冲液配制成1琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度05UG/ML）。将平板放入水平电泳槽中，加入1TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增6UL与1UL上样缓冲液混合，分别加入样品孔中，取5ULDNAMARKERDL2000加入到标准分子量对照孔内。5V/CM恒压电泳30MIN45MIN。8结果判定待检样品扩增出307BP或306BP的特异性片段，即可判定为含有梅花鹿或马鹿鹿茸。必要时取PCR扩增产物进行测序，结果与附录A参考序列比较，序列相似性在95以上，可进一步确定待测样品结果为阳性。9废弃物处理和防止污染的措施91检测过程中防止交叉污染按照GB/T27403规定执行。DB22/T26002016492检测过程中的废弃物需经121高压灭菌处理至少30MIN。DB22/T260020165AA附录A（资料性附录）梅花鹿、马鹿的特征性序列A1梅花鹿特异扩增片段序列（307BP）ACAAAGCACGTGATATAACCTTATGTGTTTGTAGTACATAAAATTAATGCATTAAGGCACACATGTACAATGGTACATAAAATCGGTGTATAGGACATATTATGCATAATAGTACATAAATTAATGTATTAGGACATACTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTATTTTCTATTATCTACAGTACATAGTACATGATGTTGCTTATCGTACATAGCGCATTGAGTCAAATCAGTCCTCGTCAGCATGCGTATCCCGTCCACTAGATCACGAGCTTGATCACCATGA2马鹿特异扩增片段序列（306BP）GCAAAACACGTGATATAACCTTATGCGCTTGTAGTACATAAAATCAATGTACTAGGACATGCATGTATAACAGTACATAAGTTAGCGTATAGGACATATTATGTATAATAGTACATAAATTAATGTATCAGGACATATTATGTATAATAGTACAT