五味子中五味子甲素和乙素含量测定分析方法的建立 论文正文

毕业论文（设计）题目五味子中五味子甲素和乙素含量测定分析方法的建立指导老师何丰专业班级生物技术及应用0701姓名王丝丝学号2010年5月30日摘要本文建立了五味子中五味子甲素和乙素含量同时测定的方法。色谱柱为DIAMONSILC18柱（25046MM，5M），流动相为甲醇水乙腈70237V/V，流速为10MLMIN1，柱温为25，检测波长为224NM，进样量10L，分析时间为30MIN，峰对称性分别为095和096，且在224NM处的响应值比254NM处明显增加。该流动相可以有效分析五味子样品中五味子甲素和乙素含量，并能达到较好分离效果。五味子甲素和乙素的分离度15，理论塔板数为4000，体系避开了缓冲盐对泵系统的影响，并且加入少量乙腈代替甲醇降低柱压。样品中五味子甲素和乙素精密度的RSD分别为116和143，稳定性RSD分别为128和229，重现性RSD分别为294和299，平均加样回收率分别为1002和995，符合我国药典对药物分析的要求。可用于后面各项试验中五味子甲素和乙素的定量和定性分析。关键词五味子；五味子甲素；五味子乙素；分析方法目录引言11材料与仪器111材料与试剂112仪器设备22试验方法221样品溶液的检测方法222色谱分析条件及系统适应性试验223标准曲线的制备224精密度试验325重现性试验326稳定性试验327加样回收率试验33结果331系统适应性332线性关系533精密度634稳定性635重现性736加样回收率84结论9参考文献10引言五味子甲素和乙素SCHIZANDRIN是五味子中的一类主要有效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、护肝降酶、抑制肿瘤细胞多药耐药性的产生、对抗心肌灌注性损伤等多种生物学活性。是诸多五味子药材及其制剂质量评价中的一个通常采用的质量指标，多种含有五味子的中成药用其作为指标性成分进行质量控制。五味子甲素和乙素的分析方法研究较成熟，最常见的方法有薄层色谱扫描法1,2,反相高效液相色谱法3,4,5，高速逆流色谱法6等。五味子乙素在254NM处有最大的吸收峰，因此常采用254NM处的吸收波长进行测定。HPLC法是目前最常用的分析方法。据报道，最佳的两种样品的预处理方法是甲醇或乙醇回流法和甲醇或乙醇超声法。流动相体系采用甲醇水（酸水或盐溶液体系）7，乙腈水体系8，乙腈水甲醇体系9等。本研究采用甲醇超声处理五味子样品，甲醇乙腈水为流动相，检测波长选224NM。1材料与仪器11材料与试剂乙睛色谱纯，德国MERCK公司甲醇色谱纯，德国MERCK公司超纯水（哇哈哈）甲醇分析纯，衙州巨化试剂有限公司微孔滤膜油膜，04UM不锈钢滤头大连伊利特有限公司五味子样品（北五味子，购于北京同仁堂）五味子乙素对照品117065200707，供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供五味子甲素对照品（0764200807，供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供）12仪器设备电子分析天平梅特勒托利多AL204分析天平，称量范围001G200G戴安高效液相色谱仪；DIAMONSILC18柱250X46MM,5UMDIKMA超声波清洗器KQ100型超声波清洗器，昆山市超声仪器厂架盘药物天平（马头牌BPII型，称量范围05G500G，上海医用激光仪器厂）150ML磨口具塞锥形瓶10ML的容量瓶2试验方法21样品溶液的检测方法精确称取05G五味子样品粗粉过2号筛加入25ML甲醇后称重，超声30MIN后加甲醇补重，静置30MIN后取上清液用04M的微孔滤膜油膜过滤，取第三次的滤液作为供试液待测。22色谱分析条件及系统适应性试验分析条件色谱柱DIAMONSILC18柱25046NM,5M流动相甲醇水乙睛70237流速10MLMIN1检测波长224NM进样量10L检测时间30MIN观察供试液中五味子甲素、乙素色谱峰的对称性、分离度、响应值和理论塔板数是否符合药典规定。23标准曲线的制备五味子甲素乙素标准液制备精密称取68MG五味子甲素、82MG五味子乙素加入到10ML容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声溶解后于4条件下保存。分别将储备液稀释为34，68，102，136，170MG100ML1的甲素标准溶液和41，82，123，164，205MG100ML1的乙素标准溶液。将标准溶液用04M的微孔滤膜油膜过滤后进样量LL按上述分析条件进行HPLC分析。以五味子甲素和乙素的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，得浓度与峰面积关系的工作曲线。24精密度试验将配制的标准溶液和样品溶液都根据上述分析方法分别重复进样六次，计算六次所得峰面积的相对标准偏差。25重现性试验05G五味子粉加25ML的甲醇后称重，超声30MIN后称重加甲醇补重，静置30MIN后取上清液用04M的微孔滤膜油膜过滤，取第三次的滤液作为供试液待测。在相同条件下制备6个样品溶液，计算6个供试液五味子甲素和乙素峰面积的相对标准偏差验证供试液的批次差异是否在可信范围。26稳定性试验将标准溶液和供试品溶液分别隔2H，4H，6H，8H，10H，12H，24H进样，根据上述分析方法进行分析，计算各自在24小时内峰面积的相对标准偏差。27加样回收率试验在已知浓度的五味子提取液样品中加入和提取样液含量相近的五味子甲素和乙素，根据上述方法测定五味子甲素和乙素的含量，根据测定结果，计算出加样回收率。3结果31系统适应性流动相配比为70237，V/V的甲醇水乙腈时可达到较好的分离效果，分离度15，理论塔板数为4000，峰对称性分别为095、096，在224NM的峰面积是254NM处峰面积的35倍。该分析方法明显提高了五味子甲素和乙素的响应值，并且能够避开各炮制品或生品供试液中其它物质对五味子甲素和乙素检测的干扰。理论塔板数、峰对称性以及分离度均可达到我国药典对药物分析的要求。标准品和供试品有代表性的色谱图见图31、32。02406801201460182024062803203502046081021406180五味子甲素乙素25五味子甲素乙素2UV_IS1MAUMIN167539283196573914357461958172065WL24NM图31标准品色谱图五味子甲素标准品五味子乙素标准品020460810201460182002460283020350212503756270851,2501,4五味子甲素乙素23五味子甲素乙素2UV_IS1MAUMIN1923607150627639842109561076513508246157921483974691456WL24NM图32供试品色谱图32线性关系以五味子甲素和乙素的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标作图，得出五味子甲素和乙素峰面积与浓度的线性关系见图33、34。五味子甲素标准溶液的线性方程Y80441X035，R209999，结果表明五味子甲素含量在0034到0170MGML1范围内与峰面积有良好的线性关系，见图33；五味子乙素标准溶液的线性方程Y33244X003，R209994，结果表明五味子乙素含量在0041到0205MGML1范围内与峰面积有良好的线性关系，见图34。五味子甲素样品五味子乙素样品图33五味子甲素的标准曲线图34五味子乙素的标准曲线33精密度6个五味子甲素标准溶液、乙素标准溶液和样品溶液的RSD分别为118和120，样品溶液的RSD分别为116和143，分析仪器的分析误差在可信范围内。具体数据见表31、32和33、34。表32标准溶液五味子乙素的精密度峰面积平均值RSD516516120508523514513524表31标准溶液五味子甲素精密度峰面积平均值RSD608614118612621625609608表33样品溶液五味子甲素精密度峰面积平均值RSD30830631231330531330911634稳定性结果显示标液中的五味子甲素、乙素和供试液中的五味子甲素、乙素在24小时内有较好稳定性。五味子甲素标液、乙素标液在24小时内测定值RSD分别为072和065；供试液五味子甲素和乙素在24小时内测定值RSD分别为128和229。标液和样液的稳定性数据见表35、36、37和38表35标准溶液五味子甲素的稳定性表36标准溶液五味子乙素的稳定性时间H峰面积平均值RSD2615611072461866098605106121260824613时间H峰面积平均值RSD2522518065451765218515105131251824521表34样品溶液五味子乙素的精密度峰面积平均值RSD258258143253260262255262表37样品溶液中五味子甲素的稳定性表38样品溶液中五味子乙素的稳定性35重现性在相同条件下制备的6个五味子样品中五味子甲素和五味子乙素的含量差别不大，甲素和乙素的6个数据的RSD值分别为294和299，样品的重现性数据见表39、310。表39样品制备中的五味子甲素重现性数据样品五味子甲素含量（MG/G）平均值RSD样品1131样品2127样品3136样品4128样品5125129294时间H峰面积平均值RSD2305311128431463098312103061231424315时间H峰面积平均值RSD2252260229425862618266102541226824263样品6128表310样品制备中的五味子乙素重现性数据样品五味子乙素含量（MG/G）平均值RSD样品1185样品2192样品3188样品4194样品5179样品618318729936加样回收率五味子炮制品样液中五味子甲素和五味子乙素的平均加样回收率分别为1002和995，RSD分别为368和190，平均加样回收率在95105之间，符合药典常用的分析标准。五味子甲素和五味子乙素的加样回收率数据如表311和312。表311五味子甲素加样回收率数据样品检测到量MG加入量MG加样回收率平均值RSD1024902569722026802561046302480256969402620256102310023685024702569656026502561035表312五味子乙素加样回收率数据样品检测到量MG加入量MG加样回收率平均值RSD103730365102220360036598630368036510084035403659705035803659816036303659959951904结论采用如下的分析条件色谱柱为DIAMONSILC18柱（25046MM，5M），流动相为甲醇水乙腈70237V/V，流速为10MLMIN1，柱温为25，检测波长为224NM，进样量10L，分析时间为30MIN，峰对称性分别为095和096，且在224NM处的响应值比254NM处明显增加。该流动相可以有效分析五味子样品中五味子甲素和乙素含量，并能达到较好分离效果。五味子甲素和乙素的分离度15，理论塔板数为4000，体系避开了缓冲盐对泵系统的影响，并且加入少量乙腈代替甲醇降低柱压。样品中五味子甲素和乙素精密度的RSD分别为116和143，稳定性RSD分别为128和229，重现性RSD分别为294和299，平均加样回收率分别为1002和995，符合我国药典对药物分析的要求。可用于后面各项试验中五味子甲素和乙素的定量和定性分析。参考文献1赵恒,徐景仁北五味子及其制剂三苓丹胶囊中五味子乙素的薄层光密度法测定J药物分析杂志1995,15133352王胜春,贺雪梅,樊亚萱薄层扫描法测定五灵胶囊中五味子乙素的含量J第四军医大学学报1998,44784793黄萍,王体强HPLC法测定护肝颗粒剂中五味子乙素含量的探讨J重庆医科大学学报2002,2721671704谭生建,屈雪莲肝复康丸中五味子甲素和五味子乙素含量测定方法研究J解放军药学学报2002晓斌,李颖HPLC测定生脉胶囊中五味子甲素和乙素的含量J华西药学杂志2003,1821411426刘力生,肖显华,王肖莹等五味子素对癌细胞DNA，ATP和核蛋白代谢的影响J中国药理学报1984,5213