基于quechers前处理技术和弱阳离子交换色谱的牛奶和奶粉中三聚氰胺的快速检测

特别策划食品安全检测研究论文DOI103724/SPJ1123201100687基于QUECHERS前处理技术和弱阳离子交换色谱的牛奶和奶粉中三聚氰胺的快速检测方法郭志谋23,章飞芳13,魏杰1,沈爱金2,梁鑫淼1,21华东理工大学药学院,上海2002372中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连116023摘要应用QUECHERS前处理技术,并结合弱阳离子交换色谱,建立了牛奶和奶粉中三聚氰胺的快速检测方法。样品使用医用酒精乙醇含量75和一种新型脂肪吸附LAS材料超声振荡处理,在沉淀吸附蛋白质和脂肪的同时提取三聚氰胺,然后经8000R/MIN离心,上清液过膜直接分析。色谱分析在弱阳离子交换色谱柱WCX上进行,采用2MMOL/LPH为318的磷酸二氢钾水溶液为流动相,在5MIN内实现分离分析。结果表明,该方法在010220MG/L内线性相关系数大于019999。在150MG/KG添加浓度范围内,牛奶的平均回收率为981910512,相对标准偏差RSD为019314奶粉的平均回收率为861410219,RSD为115617。本方法的检出限为0105MG/KG牛奶和011MG/KG奶粉。整个分析检测过程没有使用有毒有害有机溶剂,是一种绿色的分析方法。关键词QUECHERS方法弱阳离子交换色谱快速分析三聚氰胺牛奶奶粉文章编号10002871320110720687204中图分类号O658文献标识码ARAPIDANALYSISOFMELAMINEINMILKANDMILKPOWDERUSINGQUECHERSAPPROACHCOUPLEDWITHWEAKCATIONEXCHANGECHROMATOGRAPHY2313121,2WEIJIE,GUOZHIMOU,SHENAIJIN,ZHANGFEIFANG,LIANGXINMIAO1SCHOOLOFPHARMACY,EASTCHINAUNIVERSITYOFSCIENCEANDTECHNOLOGY,SHANGHAI200237,CHINA2DALIANINSTITUTEOFCHEMICALPHYSICS,CHINESEACADEMYOFSCIENCES,DALIAN116023,CHINAABSTRACTASIMPLE,RAPIDMETHODFORTHEDETERMINATIONOFMELAMINEINMILKANDMILKPOWDERWASDEVELOPEDUSINGQUECHERSAPPROACHCOUPLEDWITHWEAKCATIONEXCHANGECHROMATOGRAPHYWCXTHESAMPLESWEREEXTRACTEDANDCLEANED2UPBYMEDICINALALCOHOLANDLIPIDADSORBENTHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATO2ONAWCXCOLUMN150MM416LASSIMULTANEOUSLY,THENCENTRIFUGEDANDFILTEREDFORGRAPHICHPLCANALYSISTHESEPARATIONWASPERFORMEDMM,5MWITH2MMOL/LKH2PO4PH318ASMOBILEPHASETHEFLOWRATEWAS115ML/MINVOLUMEWAS20LANDTHECOLUMNGOODLINEARITYWASOBTAINEDINTHEOF019999FORSAMPLESSPIKEDWITHANDTHEDETECTIONWAVELENGTHWAS208NMTHEINJECTIONTEMPERATUREWAS30UNDERTHEOPTIMIZEDCONDITIONS,RANGEOF010220MG/LWITHACORRELATIONCOEFFICIENTR2MELAMINESTANDARDINTHERANGEOF150MG/KG,THEAVERAGERECOVERIESOFSTANDARDINTHEMILKANDMILKPOWDERWERE981910512AND861410219,RESPECTIVELYTHERELATIVESTAND2ARDDEVIATIONSWERE019314AND115617,RESPECTIVELYTHELIMITSOFDETECTIONLOD,S/N3WERE0105MG/KGMILKAND011MG/KGMILKPOWDERTHEPRESENTMETHODISGREENDUETONOTUSEOFTHETOXICORGANICSOLVENTSKEYWORDSQUECHERSWEAKCATIONEXCHANGECHROMATOGRAPHYWCXRAPIDANALYSISMELA2MINEMILKMILKPOWDER3通讯联系人章飞芳,博士,主要研究方向为食品安全分析E2MAILZHANGFFECUSTEDUCN郭志谋,博士,主要研究方向为新型分离材料与分离技术E2MAILGUOZHIMOUDICPACCN基金项目国家科技支撑计划项目NO2009BADB9B02和上海市科委重点基础研究项目NO09JC1403900收稿日期2011201227688色谱第29卷三聚氰胺MELAMINE是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,因其相对较高的含氮量6617被一些不法商贩添加到乳制品中冒充蛋白质,人体长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统损害,引起膀胱、肾部结石,并进一步诱发膀胱癌。因此,有必要发展乳制品中三聚氰胺的快速检测方法,加强质量监控。但是,乳制品中存在大量的蛋白质和脂肪等复杂基质,检测中基质干扰严重,需发展有效的样品前处理提取和净化方法来检测三聚氰胺。目前,文献报道了多种三聚氰胺的前处理方法18。主要采用三氯乙酸、三氯乙酸2乙腈、三氯乙酸2乙酸铅、高氯酸、乙腈2高氯酸、乙腈2水、甲醇2甲酸等作为提取溶剂,然后提取液经过阳离子交换固相萃取柱净化。这些前处理方法有效地提取和净化了样品,但步骤繁琐、耗时且使用SPE固相萃取柱净化增加了样品前处理复杂程度和检测成本。部分文献报道样品经溶剂提取后直接过膜分析5,7,8,但是样品可能含有大量脂肪、蛋白质等基质分子,直接分析基质干扰较大,还可能对色谱柱寿命产生影响。另外,这些前处理方法大都需要使用有毒有害试剂。另外,近年来也有报道使用聚合物整体柱9,10进行奶制品中三聚氰胺的样品前处理,也能达到很好的结果。三聚氰胺是亲水性小分子,文献报道多用离子对色谱1,2,11,12、亲水作用色谱36,13、强阳离子交换色谱7,14进行分离分析。离子对色谱存在平衡时间长、重复性差、色谱柱易损坏等缺点,影响方法的重现性和灵敏度。而亲水作用色谱基质干扰较大,需使用大量乙腈,分析成本较高。强阳离子交换色谱需较高浓度缓冲盐和一定浓度有机溶剂。QUECHERS是LEHOTAY等15于2003年提出的一种样品前处理方法,该方法包括基于分配机理的样品提取和加入吸附剂的分散固相萃取两个步骤,操作简单,可高效、快速地提取净化样品,主要用于农药残留的提取净化。本文采用QUECHERS样品前处理方法进行牛奶和奶粉样品前处理,使用医用酒精结合一种商品化脂肪吸附LIPIDADSORBENT,LAS材料来提取三聚氰胺,同时沉淀吸附蛋白质和脂肪等基质实现样品的净化,所得上清液采用弱阳离子交换WCX色谱柱进行分离分析,为三聚氰胺的快速检测提供一种新方法。色谱柱大连思谱精工有限公司,150MM416MM,5MSORVALL离心机美国THERMOFISHERSCIENTIFIC公司MILLI2Q纯水系统美国MILLIPORE公司KQ5200DE超声仪江苏昆山超声仪器有限公司。三聚氰胺分析纯,天津市光复精细化工研究所医用酒精乙醇含量75,盘锦天源药业有限公司LAS材料粒径60M,大连思谱精工有限公司磷酸二氢钾纯度9910,SIGMA2ALDRICH公司磷酸含量85,美国TEDIA公司。12标准溶液配制准确称取25MG三聚氰胺标准品,用水溶解并定容至25ML,配制成1G/L的三聚氰胺标准储备液,放置于4冰箱中避光保存。用H3PO4/医用酒精0101/100,V/V逐级稀释三聚氰胺储备液,配制成0102、011、012、015、2、5和20MG/L的标准溶液。13样品前处理准确称取奶粉015G或液态奶110G精确到0101G置于10ML离心管中奶粉中加入1ML去离子水混匀溶解,用HPO/医用酒精0101/100,34V/V定容至5ML,混匀。然后取1GLAS材料加入上述样品中,混匀,超声1MIN,于8000R/MIN离心2MIN,取上清液过0122M微孔滤膜,直接进行液相分析。14色谱条件色谱柱采用WCX色谱柱150MM416MM,柱温30流动相采用2MMOL/LKH2PO4用磷酸调节PH为318流速115ML/MIN进样体积20L分析时间5MIN二极管阵列检测器波长扫描范围为200400NM,以保留时间和三聚氰胺的紫外光谱图定性,外标法定量。2结果与讨论21提取净化条件的选择和优化牛奶和奶粉的基质成分复杂,含有大量蛋白质和脂肪,有效的样品前处理是检测三聚氰胺的关键步骤。如前所述,现有前处理方法大都存在步骤繁琐、耗时等缺点一些快速方法,如国家标准GB/T2240022008,使用乙腈提取会引起部分脂肪类物质溶解,对检测产生较大干扰另一方面,提取过程使用有毒有机溶剂,对人员和环境存在不利影响。三聚氰胺是强极性亲水小分子,牛奶中的蛋白质和脂肪等基质多为疏水性物质,两者在性质上存在较大差异。LAS材料为强疏水性材料,对疏水性蛋白和1实验部分11仪器与试剂WATERS2695高效液相色谱仪,配有WATERS2996二极管阵列检测器美国WATERS公司WCX19942013CHINAACADEMICJOURNALELECTRONICPUBLISHINGHOUSEALLRIGHTSRESERVEDHTTP/WWWCNKINET魏杰,等基于QUECHERS前处理技术和弱阳离子交换色谱的牛奶和奶粉中三聚氰胺的快速检测方法第7期689脂肪有很强的吸附能力,可在高有机相75乙醇浓度下吸附蛋白质和脂肪,并且辅助蛋白质和脂肪沉淀。同时对亲水性的三聚氰胺不产生吸附,实现三聚氰胺与基质的分离,达到净化样品的目的。另外,医用酒精也可沉淀一部分蛋白质分子,进一步净化样品。因此,选用医用酒精乙醇含量75和LAS材料提取三聚氰胺能够同时沉淀吸附蛋白质和脂肪,直接获得澄清透明溶液,所得样品过膜直接分析,具有基质干扰小,环境友好的优点。对照实验结果显示,只用医用酒精处理,不加入LAS材料,样品经离心后得不到澄清溶液,无法直接进行分析,证实加入LAS材料有助于沉淀吸附脂肪、蛋白质等基质,降低基质干扰,实现直接检测见图1。MIN完成一个样品的前处理,67MIN完成一个样品的检测工作。图2A2MG/L三聚氰胺标准溶液、B添加10MG/KG三聚氰胺的牛奶样品和C空白牛奶样品的色谱图CHROMATOGRAMSOFAA2MG/LMELAMINESOLUTION,BAMILKSAMPLESPIKEDWITH10MG/KGMELAMINEANDCABLANKMILKSAMPLEFIG2三聚氰胺在紫外光区有两个特征吸收,分别为208NM和236NM。文献报道三聚氰胺的分析大都选用240NM作为检测波长,其原因是所选用的流动相体系和样品基质在三聚氰胺最大吸收波长处208NM干扰较大。本方法前处理得到的样品纯净,且使用低浓度磷酸盐做流动相,在低波长下干扰小,故选用208NM作为检测波长,提高检测灵敏度见图3。图1A牛奶样品、B只加入医用酒精离心处理的样品和C加入医用酒精和LAS材料离心处理的样品FIG1AMILKSAMPLE,BMILKSAMPLETREATEDWITHMEDICINALALCOHOLANDCMILKSAMPLETREATEDWITHMEDICINALALCOHOLANDLASMATERIAL22色谱条件的选择三聚氰胺为极性小分子,在反相色谱分析中需加入离子对试剂,存在平衡时间长、重复性差、色谱柱寿命短等缺点,影响方法的重现性和灵敏度。由于三聚氰胺显碱性,可用离子色谱分析。GB/T2240022008采用强阳离子交换SCX色谱进行三聚氰胺的分离分析。SCX对三聚氰胺保留较强,需使用较高浓度的缓冲盐和一定浓度的有机溶剂。弱阳离子交换WCX色谱在低PH下离子交换容量较小,使用低浓度缓冲盐2MMOL/LKH2PO4,PH318即可实现三聚氰胺的洗脱和分离。另外,一些小分子酸、亲脂性物质等基质保留很弱或不保留,不会对三聚氰胺的检测产生干扰,纯水相条件下可在5MIN内实现基质干扰物与三聚氰胺的快速分离见图2。在实际操作中,可将医用酒精和LAS材料提前分装好,超声、离心操作均可批量处理,分摊到一个样品只剩下样品称取的时间,可平均12图3三聚氰胺20MG/L在A208NM和B240NM的色谱图FIG3CHROMATOGRAMSOFMELAMINE20MG/LATA208NMANDB240NM23线性范围和检出限将112节中配制的不同质量浓度0102、011、012、015、2、5、20MG/L的标准溶液重复分析3次,用所得到的峰面积平均值为纵坐标,三聚氰胺的质量浓度MG/L为横坐标建立回归曲线,结果表明三聚氰胺在010220MG/L内线性关系良好,相关系数R2为019999,回归方程为Y203719X19942013CHINAACADEMICJOURNALELECTRONICPUBLISHINGHOUSEALLRIGHTSRESERVEDHTTP/WWWCNKINET690色谱第29卷291211。在空白牛奶和奶粉基质中添加三聚氰胺,按信噪比S/N大于3计算,本方法的检出限分别为0105MG/KG牛奶和011MG/KG奶粉。24回收率和精密度在空白奶粉基质中添加2、5、10、30、50MG/KG5个浓度水平,牛奶基质中添加1、5、10、30、50MG/KG5个浓度水平的三聚氰胺进行加标回收率测定,每个浓度平行测定5次,用回归方程计算加标回收率和相对标准偏差RSD。如表1所示,牛奶中三聚氰胺的回收率为981910512,RSD为019314奶粉中三聚氰胺的回收率为861410219,RSD为115617。25实际样品分析使用本方法对市场上随机抽取的一种牛奶和一种奶粉样品进行检测,结果见图4,在两个样品中均没有检到三聚氰胺。表1奶粉和牛奶基质中三聚氰胺的添加回收率和精密度N5TABLE1RECOVERIESANDPRECISIONSOFMELAMINEINMILKANDMILKPOWDERSAMPLESN5MILKMILKPOWDERADDED/MG/KGRECOVERY/RSD/ADDED/MG/KGRECOVERY/RSD/1510301052100899798934342209251030900864906100367505825509991850102915图4A1牛奶实际样品、A2空白牛奶加标样品、B1奶粉实际样品和B2空白奶粉加标样品的色谱图加标量均为10MG/KGFIG4CHROMATOGRAMSOFA1AREALMILKSAMPLE,A2ABLANKMILKSAMPLESPIKEDWITH10MG/KGMELAMINE,B1AREALMILKPOWDERSAMPLEANDB2ABLANKMILKPOWDERSAMPLESPIKEDWITH10MG/KGMELAMINE等中国卫生检验杂志,2010,2092184IHUNEGBOFN,TESFALIDETS,JIANGWJSEPSCI,2010,336/7988MEISB,HOUJ,ZHANGWG,ETALCHINESEJOURNALOFCHROMATOGRAPHY梅少博,侯晋,张文国,等色谱,2010,28121189GB/T2240022008VACLAVIKL,ROSMUSJ,POPPINGB,ETALJCHROMATOGRA,2010,1217254204MAQ,HUXZ,HUANGJC,ETALCHINESEJOURNALOFCHRO2MATOGRAPHY马乔,胡西洲,黄晋萃,等色谱,2009,275731LIXY,WANGY,GUX,ETALCHINESEJOURNALOFCHROMA2TOGRAPHY李新燕,王彦,谷雪,等色谱,2010,283231GB/T2238822008SONGSF,LUJ,FANGCR,ETALCHINESEJOURNALOFFOODHYGIENE宋书锋,鲁杰,方从容,等中国食品卫生杂志,2009,21127DESMARCHELIERA,CUADRAMG,