【毕业论文】维生素c和牛磺酸对麦穗鱼抗缺氧能力的影响外文翻译

饲料中维生素A的含量对大西洋鲑鱼免疫功能的影响引言近年来，已经有大量研究显示了微量元素对鱼类免疫系统的影响，目的是提供一种通过饮食调整加强疾病抵抗能力的途径。这些研究的大部分都集中在维生素的免疫调节作用上，特别是维生素C和维生素E。然而，饲喂高含量维生素A的潜在好处很大程度上被忽视了。维生素A包括所有具有视黄醇的生物学活性的化合物。这些化合物是从饮食中直接或间接获得的、通过酶修饰的类胡萝卜素（维生素A原）前体。大西洋鲑鱼主要的维生素原是虾青素，这种化合物在野生的甲壳类动物中含量很高。维生素A从肠道被吸收，主要以视黄酯的形式被储存在肝脏中。这类贮存物质可以重新水解产生游离的视黄醇，它被一种特殊的运输蛋白（视黄醇结合蛋白）结合在血浆中，进而遍布全身。对哺乳动物和禽类的研究显示，维生素A在特异性和非特异性免疫中担任了重要角色。对斑点叉尾鮰的实验显示在活体和离体实验中，自然细胞毒性的细胞活力在高浓度的维生素A之下都增强。本研究是为了确定维生素A对鲑鱼免疫系统的影响，并且探究在水产养殖中维生素A在抗病中的作用。本研究在大西洋鲑属的大西洋鲑的饲料中添加低、中、高浓度的维生素A，持续4个月，之后对一系列的细胞免疫和体液免疫指标进行了检测。材料和方法鲑鱼的饲养大西洋鲑鱼幼鱼（平均重量20G）饲养于阿伯丁的苏格兰农业与渔业事务部（SOAFD）海洋实验室。实验用鱼在化学和生物过滤器的半循环养殖系统中，其中包括6个420升容量的圆形水箱，可以以10升/分钟的速度提供恒温（11）的海水（30盐度），以及10小时光照14小时黑暗的光照制度。450条幼鲑被平均分配到水池中。幼鲑被饲喂基于酪蛋白的饮食（表1）。在基础日粮中，每千克干饲料含有037毫克的微维生素A，最终，在实验开始之前，根据HPLC的分析，维生素A的含量被增加到每千克干饲料195毫克（中）和每千克干饲料15毫克。日粮于20的环境中贮存，并且在实验过程中，没有观察到维生素A活性的损失。配对水箱中的幼鲑以体重15的重量饲喂不同种类的试验饲料，持续4个月。每月测量一次各组的总重量，并根据测量结果调整投饲率。4个月之后，每个组的特定生长率（SGR；体重每天）使用下式计算SGR100LOGNWFLOGNWI/T其中WI和WF分别为T天后每组各自初始和最终的重量（RICKER，1979）。此时从每罐中取出5条幼鲑，评估肝脏内的维生素A水平。对余下的鱼的免疫学研究表明，体内维生素A的水平反映了日粮的投饲。实验用鱼从三个投饲组中随机抽样，敲击头部致死后，从尾静脉采血，用于免疫参数的测定。先将血液在室温下凝结2小时，之后以10,000转/分钟的速度离心5分钟，将所得到的血清保存在70，以供日后分析。放血之后，每条鱼都被解剖，取出肾脏，置于含有2小牛血清（FCS）和每毫升10U肝素的莱博维茨15培养基（L15；GIBCO）中，并置于冰上，用以制备白细胞悬浮液，根据BRADFORD的方法（1976）测定血清蛋白。维生素A的测定肝取最多05G的肝脏，于10ML刻度试管中，在04G乙醇邻苯三酚（20MG/ML的95乙醇中）中匀浆，70水浴加热5分钟。取出试管，氮气鼓泡后加入1毫升60的氢氧化钾。再将试管放回水浴20分钟，不时摇动。在此之后将皂化的组织匀浆在冰上冷却。然后加超纯水至10ML，并加入4ML含有125PTG/ML二叔丁基对甲酚（BHT）的己烷。将试管剧烈震荡2分钟，然后放入黑暗环境中待用。在一个25046毫米的ALPHASILC18反相柱（HPLC技术有限公司）上，己烷（HPLC级）中含有1异丙醇作为流动相，流速为1ML/MIN。注射100L的己烷提取物，维生素A将被HPLC分离。视黄醇是以PERKINELMER荧光分光光度计在325NM处以及日本岛津CRIB测定仪检测。在分析提取之前，己烷萃取物被保存在40的黑暗环境中。在方法验证的过程中，视黄醇尖峰证实，提取过程中实现了95的回收率。结果用G视黄醇/G肝脏来表示。日粮2G样品日粮分成三份，用杵和研钵研磨，之后在70的条件下，于100ML含10克氢氧化钾的乙醇邻苯三酚中，在暗处回流30分钟。然后将培养瓶在冰上冷却，并加入200毫升的超纯水。维生素A被提取到含有125G/MLBHT的正己烷中。5毫升己烷提取物用5毫升的超纯水洗涤两次，视黄醇如上所述分析。结果用MG视黄醇/KG干饲料来表示。细胞介导的免疫参数呼吸爆发活动用上面所述的方法，从肾脏制备白细胞悬浮液，以51/34硅石胶态悬浮液密度梯度分层，并以400转/分钟离心30分钟。将表面的巨噬细胞富集馏分除去，并在含有每毫升10U肝素和2FCS的L15培养基中洗涤两次，并调节至每毫升106个活细胞。用佛波醇12肉豆蔻酸酯13乙酸酯（PMA，SIGMA社制）进行膜刺激，测定亚铁细胞色素C的减少程度，以对吞噬细胞的呼吸爆发程度进行定量。结果用15分钟内产生O2的纳摩尔数/105个肾白细胞数来表示。巨噬细胞的杀菌活性如上所述，从肾脏制备白细胞悬浮液并富集吞噬细胞，在含01FCS的L15培养基中，调整细胞数量到107个活细胞/毫升。将100L等份的细胞加入到96孔微量滴定板中，并在18保持2H，等待粘附。未粘附的细胞用L15培养基洗掉，给余下的巨噬细胞补充含有5FCS的L15培养基。48小时后，将巨噬细胞层用L15培养基洗去。这些巨噬细胞杀死无毒菌株（A层阴性MT004）的能力，根据GRAHAM等人的方法（1988）进行测定，使用的菌株浓度为2106个/ML。结果用细菌被杀灭的百分比表示。淋巴产量肾白细胞悬浮液在51硅石胶态悬浮液中分层，然后以400转/分钟的速度离心30分钟，以除去红细胞。从硅石胶态悬浮液与培养基的界面处收集白细胞，之后如上文所述洗涤，然后在含有5105M的2巯基乙醇（2ME）的L15培养基中，调整细胞个数至5106个/ML。将一毫升的等分试样加入到24孔组织培养板中，并根据由GRAHAM和SECOMBES的描述的草案（1990）刺激巨噬细胞活化因子（MAF）生产。将14和18稀释液所得到的上清液加入如前面所述从一个单一的大库存中鲑鱼分离的巨噬细胞单层中，以测定MAF的活力。48H后，上清液被冲洗掉，然后进行一个呼吸突发吸附试验（亚铁细胞色素C减少的程度）以确定激活的程度。结果用刺激指数表示，阴性对照组所产生的量除以活化的巨噬细胞所产生的O2量。白细胞迁移如前面描述的，制备吞噬细胞富集的细胞悬浮液，然后根据前面所述的（THOMPSON等人，1993）研究其对于新鲜的鲑鱼血清（在HANKS平衡盐溶液中以150稀释HBSS）的迁移反应。结果用每平方毫米的过滤器的上述本底水准（只计算HBSS）的细胞迁移的数目表示。二十烷的产出如上所述，将白细胞悬浮液在51硅石胶态悬浮液中分层并纯化。在L15培养基中，将细胞数量调整至5106个活细胞/ML，然后用5M的钙离子（SIGMA）处理。根据ROWLEY的草案（1992），用HPLC对所得的上清液做脂氧素（LXA4）与白三烯（LTB4和LTB5）的活力分析。结果用每NG产物/106个白细胞表示。体液免疫参数抗蛋白酶的活性采用以ELLIS的试验为基础的修改试验，利用鲑鱼抗蛋白酶抑制胰蛋白酶的活性测定血清抗蛋白酶的活性。在圆底96孔微量滴定板中，将试验血清于PH为80的005M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液中进行连续稀释。将5L溶液转移至平底96孔微量滴定板中，并加入15微升的胰蛋白酶（在TBS中每毫升100微克），在室温下混合5分钟。将200L的NA苯甲酰基DL精氨酸对硝基酰苯胺（BAPNA）底物溶液（在PH为74的20毫升的001M三羟甲基氨基甲烷/CACL2的缓冲液，其中每2毫升二甲基甲酰胺中含104毫克BAPNA）加入各孔中，之后以TBS/BAPNA空白作对照，在多扫描分光光度计（MDCTHERMOMAX公司）中以450NM的波长做15分钟的动力学运作，来测定未被抑制的胰蛋白酶作用物的分解代谢。读数被转换成单位胰蛋白酶/毫升，之后测定每个样品的胰蛋白酶的活性的被抑制85所需的血清体积。结果用胰蛋白酶当量/毫升血清表示。溶菌酶活性血清溶菌酶的活性是通过测量溶壁微球菌（75毫克含有009氯化钠的每100毫升01M磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液，PH值58）的悬浮液中的溶解率来测定的。将175微升该悬浮液中加入25L的每个血清样品，这对应鸡蛋白溶菌酶（SIGMA公司）的标准（010皮克/毫升磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液）。摇晃平板，然后在25，以一个MLYSODEIKTICUS空白作对照，以450NM的波长，在多扫描分光光度计（MDCTHERMOMAX公司）上做5分钟的动力学运作，以确定裂解率。从标准曲线计算出血清中的溶菌酶浓度，结果表示为克溶菌酶/毫升血清。经典补体活性用以前所述的方法研究了绵羊红细胞（SRBC）的补体溶解对虹鳟鱼（ONCORHYNCHUSMYKISS）的抗SRBC血清的敏感。测定血清产生50溶血（CH50值）的体积，并计算出每毫升血清CH50单位的数目。血清杀菌活性在3TSB中，制备含有108个细菌/ML的ASALMONICIDA悬浮液，然后将75L该悬浮液加入96孔微量滴定板中的三份25L血清中。细菌也被添加到含有25L的3TSB溶液的微孔中，作为对照组。摇晃滴定板，在18培养3小时，每小时摇动一次。然后将培养板在150转/分的速度离心10分钟，分离出上清液。将MTT（每毫升水中5MG）在3TSB中稀释10倍，然后向所有孔中加入100L。然后将板置于黑暗环境，在18温育15分钟，并在600NM处读多扫描分光光度计（MDCTHERMOMAX公司）。杀死的细菌，通过减去的OD值量化测量对照组OD平均每个血清样本的这种差异，除以对照组的OD100，从而得出细菌被杀死的百分比。特异性抗体应答从每个配给组选择十条鱼，用苯佐卡因（25G/ML）麻醉，然后进行腹腔注射用福尔马林灭活的ASALMONICIDA（015MPH74的磷酸盐缓冲溶液；PBS中每毫升湿重10MG）使其免疫。另外十条从维生素A试验组的鱼从尾静脉放血，为每个组提供一个基础抗体效价。在免疫之后，七条维生素A试验组中已经免疫的鱼在7周之内被频繁地放血。通过ELISA测定血清抗体效价。简要地说，滴定板被100L碳酸盐缓冲溶液中的福尔马林灭活的ASALMONICIDA覆满，在4下过夜。之后用含有0005的TWEEN20的PBS溶液（PBSTWEEN）冲洗滴定板三次，再用100L含有10MG/ML牛血清白蛋白（BSA）的碳酸盐缓冲液室温下温育2H，以阻止任何非特异性结合。然后将培养板在PBSTWEEN中洗涤三次，然后将100L试验血清（在含有05MG/MLBSA的PBSTWEEN中连续稀释至125）添加到每一行的微孔中，等待2个小时。在PBSTWEEN洗涤平板三次，向所有孔中加入100L的小鼠单克隆抗鳟鱼免疫球蛋白/HRP结合物（18000，在PBSTWEEN/BSA中），等待2个小时。最后，滴定板在PBSTWEEN中洗涤三次，并且向所有孔中加入200L的1,2苯二胺二盐酸盐（ALDRICH）来制备底物溶液（04毫克/毫升含有0015的过氧化氢的01M柠檬酸缓冲液，PH值50）。在黑暗中温育30分钟之后，读取多扫描分光光度计（MDCTHERMOMAX公司）上450NM处OD的数值。结果用LOG2终点稀释（最终稀释的OD值01，获得的最高值对照血清抗原涂布的孔或免疫血清未涂布的孔）。抗病性从每个日粮组中挑选25条鱼麻醉，然后用阿尔辛蓝进行标注，以对维生素A的状况作鉴定，然后将他们放入单独的、相同的，配备有无菌水流的水槽中，用来做一个细菌实验。翌日，切断试验水槽的水流供给，然后加入ASALMONICIDA致病菌株，直到浓度达到105个细胞/毫升。夜间，水流依然被阻断，并加以强烈曝气。翌日，水槽的水流恢复供给。以16天为期限（当死亡率已经下降到0时），将死去的鱼在每天的固定时间移出水槽，记录它们的编号和维生素A状态。从起初的死亡体肾脏拭取组织，接种在胰蛋白酶大豆琼脂平板上，18培养48小时，以确认是否存在ASALMONICIDA。统计方法实验数据作以方差分析，TUKEY检验，对组间差异进行了研究。使用LOGRANK检验（PETO法，1977）测得的死亡率对疾病的试验进行了比较。实验结果四个月后，肝脏中的视黄醇水平反映了饮食中的维生素A摄入量（表2）。与正常饲喂的鱼相比，高维生素A摄入组有显著差异（P001）。在低维生素A摄入组的肝脏中，没有检测到视黄醇。在低、中、高维生素A含量的日粮组间，没有在生长率或者血浆蛋白水平上发现明显的差异（表2）。在整个实验过程中，所有的三个组都显示了正常的进食行为。体液免疫参数这些免疫参数的记录的值在表3中给出。抗蛋白酶的活性显著地受到维生素A摄入量（P005）的影响，维生素A摄入量高的组，该活性比维生素A摄入量低的组高25。在维生素A摄入量中等与高的组之间，测得的抗蛋白酶水平被认为是非显著性差异（P008）。不同群体的任一溶菌酶或补体活性之间无显著差异。同样，以ASALMONICIDA免疫7周后，发现特异性抗体的水平不受维生素A的日常摄入量影响。然而，血清杀菌活性受维生素A摄入的影响比较显著，与低维生素A摄入组相比，中等组与高量组的血清杀菌活性，大约高40（P001）与30（P005）。细胞介导的免疫参数这些免疫参数的记录的值是在表4中给出。根据巨噬细胞的杀菌活性和生产的MAF，白细胞呼吸爆发活动未受饮食中维生素A摄入量的影响，虽然与低维生素A摄入组相比，后者在高维生素A摄入组中倾向于更高。饮食中维生素A的摄入量显著影响肾白细胞迁移，在低维生素A摄入组中，比起正常维生素A摄入组中，大约减少了26。然而，高维生素A摄入组没有增强的反应。产生的白三烯（LTB4和LTB5）和脂氧素（LXA4）没有受到日粮中的维生素A摄入量影响，无论是单独或者是合并分析。然而，低维生素A摄入组的饮食与其他两组相比，在鱼类花生酸类物质水平上有明显的增高趋势。抗病能力接下来对ASALMONICIDA的试验，记录的第一次死亡是在第5天，低维生素A摄入组中。这比正常维生素A摄入组早1天，比高维生素A摄入组早2天发生。所有的组中都在持续出现死亡，直到第9天之后，只有维生素A摄入量很低或者很高的鱼死掉。最后的死亡是在试验开始后第13天记录到，这时低、中、高维生素A摄入组的死亡率分别是96，76和80。到第16天，所有存活的鱼都重新开始喂养，表现健康，到此实验结束。经LOGRANK检验显示，不同的维生素A摄入组的死亡率之间没有显着差异。讨论本研究发现了维生素A在大西洋鲑鱼中细胞介导的免疫和体液免疫等几个方面具有显著影响。通过使用3种浓度不同的维生素A日粮4个月，发现它们体内维生素A的含量不同。由于硬骨鱼自身不能合成维生素A，必须在饮食中提供以满足生理需求。维生素A主要存储在肝脏中，常用它来确定维生素A在体内的含量。由于以前的研究很少，因此在本次研究中，很难确定用这些特定维生素A的浓度喂养的鱼获得的维生素A浓度具有典型性，但是这与HILTON（1983）对鱼粉和鱼油中天然包含的维生素A含量在该研究中所使用的饲料的研究结果具有很多相似之处。在本研究的4个月期间，在低维生素A摄入组，尽管总蛋白质摄入量和合成未受影响，但特定生长率和血清蛋白的浓度明显降低。此外，在整个实验中都以低维生素A饲料饲喂的鱼，未出现因维生素A缺乏造成的视力障碍。体液免疫指标的调查显示，增加日粮维生素A水平会显著增加抗蛋白酶活性和杀菌活性。在感染过程中，中和细菌细胞外蛋白酶（ECPS）释放，抗蛋白酶是必不可少的，大西洋鲑鱼中2巨球蛋白的抗蛋白酶也在中和ASALMONICIDA的ECP中发挥重要作用。因此，可以预期，抗蛋白酶活动的增加，在高维生素A摄入的鱼中，可以增强抗病能力。根据此参数，维生素A摄入量低和正常组之间的微小差异表明维生素A并不会危及鱼类的免疫。哺乳动物的研究表明，维生素A参与1巨球蛋白的合成，即使在另一项研究中发现，2巨球蛋白的水平是不受维生素A缺乏症影响的。维生素A摄入正常与摄入高的鱼，血清杀菌活性显著地强于维生素A摄入量低的鱼，说明了维生素A缺乏会损失这种活性。杀菌活性由血清溶菌酶和补体介导，但在本研究中，溶菌酶和经典（抗体介导的）补体活性没有受到维生素A摄入量的显著影响。然而，本研究中的血清杀菌活性降低，可能是由于部分途径是补体直接在细菌表面上激活的结果。虽然这可能与维生素A低摄入量组中抗病力降低有关，但是因为ASALMONICIDA最耐（A层阳性）菌株的攻击是事实，所以这个问题依然复杂。饮食中的维生素A摄入量和特异性的体液免疫反应之间的关系也很复杂，而且往往与其他动物群体看似矛盾。例如，在人类中，维生素A的状态对特异性抗体的产量影响极小，但在缺乏维生素A的鸡中，观察到抑制T依赖性抗原的初级和次级反应，表明T细胞有功能性病变。然而，对成年大鼠的增殖反应的研究已经显示出B细胞，而不是T细胞的有丝分裂原的反应是由于维生素A缺乏症被减少引起的。虽然在本研究中，维生素A营养状况被认为对抗体的产生没有任何影响，但ASALMONICIDA很可能是一个独立的T抗原，因此对大西洋鲑鱼的进一步研究用以确认维生素A和抗体产生之间的相互作用显然是必要的。在本研究中，细胞介导的免疫反应对膳食维生素A相对不敏感。当维生素A摄入量较高时，MAF产量倾向于升高，但巨噬细胞呼吸爆发活性和杀菌活性不受饮食中维生素A摄入量的影响。缺乏的巨噬细胞呼吸爆发的影响可以解释为缺乏维生素A摄入量对吞噬细胞的杀菌活性的明显效果，因为呼吸爆发是巨噬细胞杀死ASALMONICIDA变种的主要机制。然而，这个结果是与维生素A缺乏的鸡中的呼吸爆发活性减弱比对得到的，在饲喂低水平维生素A的哺乳动物中也发现了白细胞杀菌活性的降低。维生素A缺乏症确实引起了鲑鱼白细胞体外迁移能力的明显减弱。吞噬细胞向感染部位的迁移在炎症反应中是一个重要部分，白细胞迁移能力的任何减弱都可能被预期为抗病性的减弱。在炎症反应中其他重要的组成部分是吞噬细胞的衍生物花生酸类。二十烷的产生未受维生素A摄入量的明显影响，尽管在低维生素A摄入组中，LTB4的值更加趋向升高。观察到在低维生素A摄入组中普遍较高水平的类二十烷酸产量的原因可能是由于羟酸（HETE）合成的减少，它在一些类二十烷酸的产生过程中作为中间体，通过维生素A介导，抑制花生四烯酸的酶促氧化。然而，因为LTB4已经被证明是鱼类白细胞的一种有效趋化因子，所以白细胞迁移活动的减少加上LTB4产量的增加的结果是难以预料的。高或者低的日常维生素A摄入在大西洋鲑鱼上体现的总体结论是免疫能力大概反映了他们抵抗感染的能力。分析显示，死亡率试验组与毒性ASALMONICIDA组无显著差别。然而，维生素A摄入量低的轻度免疫抑制效应是明显的，因为在该组中的