基于dna循环放大的肿瘤标志物传感分析研究

硕士学位论文MASTERDEGREETHESIS基于DNA循环放大的肿瘤标志物传感分析研究摘要本论文的主要内容是将电化学分析技术、比色分析技术、化学发光分析技术、纳米技术、DNA杂交技术以及DNA循环放大技术相结合，研制出高灵敏度、高选择性的新型DNA生物传感器，对部分肿瘤标志物进行选择性的识别和测定，为肿瘤的临床早期诊断提供基础性研究资料。本文着重描述了三种类型的DNA生物传感器的研制以及其性质的研究1研究了一种新颖且灵敏的将DNA材料和内切酶循环放大用于检测目标DNA的电化学生物传感器。工作原理如下首先，为DNA传感器组装过程，将DNA骨架连接在磁珠上，这样就扩大了量子点修饰的DNA探针着位点。其次，为内切酶的循环放大过程，构建的DNA生物传感器经过内切酶的循环放大过程，进一步提高了DNA序列的检测灵敏度。最后，为电化学检测过程，加入PBS量子点参与反应，经硝酸处理过以后，PB2的浓度变化可通过溶出伏安电流强度的变化来确定，由于目标DNA的浓度与PB2的浓度在一定范围内成正比关系，从而实现对目标DNA的检测。在实验优化级选定的最佳条件下，得到了目标DNA的线性范围为201016101015MOL/L，检测限为121016M。2在结合磁珠和酶循环放大的前期工作基础上，我们又研究了一种结合聚合酶循环放大、熵驱动过程和适体识别手段的ATP生物传感器。它用了比色检测手段对RAMOS癌细胞中的ATP含量进行了检测。传感器工作原理如下首先，构建熵驱动循环前体物。其次，加入燃料DNA、ATP适体DNA及聚合酶，构成了一个含有多个循环的反应体系。最后，加入标记了亲和素的辣根过氧化物酶（HRP），它跟含有生物素的燃料DNA结合，经磁珠分离后，HRP可催化OPDAH2O2显色，形成的OPDAH2O2AVIDINHRP体系，产生的信号用紫外分光光度计检测。因为所测ATP的含量跟AVIDINHRP含量，即，OPDAH2O2显色程度有关，并在一定范围内成一定比例关系，所以可用于检测ATP含量。在最佳实验条件下，对ATP进行了测定，检测限为611010M。并且在此基础上，实现了癌细胞中ATP含量的检测。3在以上两种生物传感器的研究基础上，我们结合最新的文献报道探索了一种检测细胞的新方法，与前两种不同的是，这种新的检测方法的研究目的不再局限于DNA或生物大分子的识别和检测，它的主要用途是检测癌细胞。其检测原理是首先，将底物DNA、RAMOS癌细胞适体DNA分别固定在链酶亲和素包被板和磁珠上，杂交互补的DNA后，形成酶循环前体。其次，加入聚合酶、连接酶、DNTPS和环DNA后，构成了一种结合聚合酶和滚环复制过程循环放大的体系。最后，再加入氯化血红素（HEMIN）反应后，形成的DNA酶可催化LUMINOLH2O2体系发光，可用微弱化学发光检测仪进行化学发光信号检测。在这个反应体系中，检测RAMOS癌细胞浓度在一定范围内跟化学发光强度有一定关系。在最佳实验条件下，对RAMOS癌细胞进行了测定，能检测到10个癌细胞。关键词循环放大；肿瘤标志物；DNA；ATP；RAMOS淋巴癌细胞THERESEARCHOFTUMOURMARKERSBIOSENSORANALYSISBASEDONDNACYCLINGAMPLIFICATIONABSTRACTTHEMAINIDEAOFTHETHISPAPERWASTOEXPLOREANOVELANDSENSITIVEBIOSENSORFORTHEDETERMINATIONOFTUMORMARKERSBASEDONELECTROCHEMICAL,COLORIMETRIC,CHEMILUMINESCENCE,NANOTECHNOLOGY,DNAHYBRIDIZATION，DNACYCLINGAMPLIFICATIONTHEBIOSENSORWEDEVELOPEDCANSELECTIVELYRECOGNIZEANDDETECTSOMEKINDSOFBIOMARKERFORTUMOR,WHICHPROVIDESBASICRESEARCHINFORMATIONTOEARLYDIAGNOSISOFCANCERINTHISPAPER,THREETYPESOFDNABIOSENSORSARESUMMARIZEDASFOLLOW1ANOVELANDSENSITIVEELECTROCHEMICALBIOSENSORSBASEDONDNAMATERIALANDTHEENZYMECYCLEAMPLIFICATIONFORTHEDETECTIONOFTARGETDNAHASBEENDEVELOPEDTHEWORKPRINCIPALSAREASFOLLOWSFIRSTLY,THEASSEMBLYPROCESSOFTHEDNASENSORTHEDNASKELETONISATTACHEDTOTHEBEADSINORDERTOEXPANDTHEDNAPROBESONTHEMODIFIEDQUANTUMDOTSSECONDLY,CYCLEAMPLIFICATIONBASEDONRESTRICTIONENDONUCLEASETHEDETECTIONSENSITIVITYOFTHEDNASEQUENCEWASFURTHERIMPROVEDBYTHECYCLEAMPLIFICATIONPROCESSOFTHEDNABIOSENSORBUILTWITHRESTRICTIONENDONUCLEASEFINALLY,THEELECTROCHEMICALDETECTIONPROCESSWEADDEDPBSQUANTUMDOTSINTOTHEREACTIONFOLLOWEDBYTHENITRICACIDTREATION,THECONCENTRATIONOFTARGETDNAISPROPORTIONALTOTHECONCENTRATIONOFPB2WITHINACERTAINRANGE,WECANDETECTTHETARGETDNATHROUGHTHECONCENTRATIONCHANGEOFPB2DETECTEDBYTHESTRIPPINGVOLTAMMETRYCURRENTINTENSITYUNDEROPTIMALCONDITIONSWITHEXPERIMENTALOPTIMIZATIONLEVEL,THELINEARRANGEOFTHETARGETDNAIS201016101015MOL/L,ANDTHEDETECTIONLIMITIS121016M2BASEDONPREVIOUSWORK，WESTUDIEDANEWATPAPTASENSORSWHICHCONTAINSPOLYMERASECYCLEAMPLIFICATION,APTAMERIDENTIFICATIONANDENTROPYDRIVENPROCESSTHEATPCONTENTINTHERAMOSCANCERCELLSWERETESTEDWITHACOLORIMETRICDETECTIONANDTHESENSORWORKSAREASFOLLOWSFIRSTLY,WEGETTHEENTROPYDRIVENPRECURSORSSECONDLY,THERESPONSEBODYCONTAINEDMORETHANONECYCLEWASCONSTITUTEDBYADDINGPOLYMERIZATIONPRECURSORSDNA,ATPAPTAMERANDPOLYMERASEFINALLY,THEHORSERADISHPEROXIDASELABELEDSTREPTAVIDINHRPWASADDED,ANDBINDTOTHEDNALABELEDBYBIOTINAFTERMAGNETICSEPARATION,HRPCANCATALYZETHEOPDAH2O2TOFORMOPDAH2O2AVIDINHRPSYSTEMWHICHCANBEDETECTEDBYUSINGAUVSPECTROPHOTOMETERASTHEMEASUREDCONTENTOFATPANDTHECONTENTOFAVIDINHRPAREPROPORTIONALTOTHEEXTENTOFTHEOPDAH2O2COLORWITHINACERTAINRANGE,ITCANBEUSEDTODETECTATPCONTENTWECARRIEDONTHEATPMEASUREMENTATTHEBESTEXPERIMENTALCONDITIONS,ANDTHEDETECTIONLIMITWAS611010MONTHISBASIS,THEDETECTIONOFATPCONTENTINCANCERCELLSWASACHIEVED3BASEDONTHEABOVETWODNASENSORS,WEEXPLOREDANEWMETHODCOMBINEDWITHTHELATESTREPORTEDLITERATUREDIFFERENTFROMTHEFIRSTTWOSENSORS,THENEWSENSORWASNOLONGERCONFINEDTOTHEIDENTIFICATIONANDDETECTIONOFDNAORBIOLOGICALMACROMOLECULES,ITSMAINPURPOSEWASTODETECTCANCERCELLSTHEDETECTIONPRINCIPLEISFIRSTLY,THESUBSTRATEDNA,RAMOSCANCERCELLSAPTAMERDNAWERESEPARATELYFIXEDONELISAPLATESANDBEADS,THEPRECURSORENZYMECYCLEWASFORMATTEDWITHTHEHYBRIDIZATIONOFCOMPLEMENTARYDNASECONDLY,WITHTHEADDITIONOFPOLYMERASE,LIGASE,DNTPSANDCIRCULARDNA,THECYCLEAMPLIFICATIONSYSTEMCOMBININGOFPOLYMERASEANDROLLINGCIRCLEREPLICATIONPROCESSWASFORMEDFINALLY,THEDNAENZYMECOULDCATALYZETHEREACTIONOFLUMINOLH2O2SYSTEMWITHTHEADDITIONOFHEMIN,ANDTHESIGNALCOULDBEDETECTEDBYWEAKCHEMILUMINESCENCEDETECTORTHECONCENTRATIONOFRAMOSCANCERCELLSANDTHECHEMICALLUMINESCENCESIGNALHASACERTAINRELATIONSHIPWITHINACERTAINRANGE,ANDTHEDETECTIONLIMITWAS10RAMOSCANCERCELLSATBESTEXPERIMENTALCONDITIONSKEYWORDSCYCLINGAMPLIFICATION,TUMORMARKERS,DNA,ATP,RAMOSCANCERCELLS目录第一章绪论11现在肿瘤方法简介111临床诊断112细胞学诊断213组织学诊断214内窥镜检查315影像学检查316同位素检查317生化检查42肿瘤标志物诊断421肿瘤标志物种类422肿瘤标志物诊断对癌症的早期诊断作用63DNA生物传感器731DNA生物传感器基本原理732DNA生物传感器的分类833DNA生物传感器的传感过程94DNA生物传感器在检测肿瘤标志物方面的应用941核酸适体9411核酸适体简介9412核酸适体的识别机理10413核酸适体在生物传感器的应用1142纳米材料在DNA生物传感器中的应用12421纳米材料的性质13422纳米粒子标记DNA探针在生物传感器中的应用1443DNA生物传感器的检测手段15431电化学检测技术15432比色检测技术17433化学发光检测技术1744DNA生物传感器检测肿瘤标记物19441基于电化学检测19442基于荧光检测19443基于化学发光检测20444基于量子点检测21445基于比色检测22446基于质量灵敏检测235本课题的目的、意义及研究内容24参考文献25第二章基于新型DNA材料内切酶循环放大构建电化学生物传感器321前言322实验部分3321仪器与试剂33211主要试剂33212仪器装置3322实验方法34221水溶性PBS量子点制备34222水溶性PBS量子点修饰的DNA生物条码探针的制备34223纳米金修饰磁珠（MBAUNPS）的制备34224磁珠修饰的DNA骨架探针的制备34225DNA电化学生物传感器的组装35226电化学检测353结果与讨论3531DNA电化学传感器的工作原理3532DNA和纳米粒子复合物的紫外光谱表征3633PBS纳米粒子的电镜表征3734优化实验条件38341优化DNA标记纳米粒子中生物条码DNA与探针DNA比例38342优化切刻内切酶反应时间38343优化切刻内切酶反应温度39344优化LINKERDNA浓度4035目标DNA的电化学检测4036传感器的选择性研究424小结42参考文献43第三章基于熵驱动DNA循环链置换反应检测癌细胞内ATP的研究461前言462实验部分4721仪器与试剂47211主要试剂47212仪器装置4822实验方法48221淋巴癌细胞中ATP的提取48222链取代底物的制备DNA标记磁珠48223ATP实验48224比色检测493结果与讨论4931链取代循环放大检测ATP工作原理4932验证基于磁珠的链取代循环过程（CYCLE1）5033对照实验5134优化实验条件52341优化KLENOW聚合酶量52342优化反应温度53343优化反应时间5335实验灵敏度5436选择性研究5537癌细胞中ATP的检测564小结56参考文献58第四章基于DNA链取代及滚环复制放大检测癌细胞的研究611前言612实验部分6121仪器与试剂62211主要试剂62212仪器装置6222实验方法62221磁珠修饰的RAMOS细胞适体探针的制备62222磁珠修饰的滚环复制探针的制备63223链酶亲和素包被板修饰的DNA复合物的制备63224传感器组装及癌细胞检测63225化学发光检测633结果与讨论6431实验原理6432金纳米颗粒修饰磁珠紫外表征6533实验可行性验证6534实验条件优化66341优化磁珠修饰探针条码比例66342优化反应时间67343优化反应温度68344优化缓冲溶液的PH值68345优化鲁米诺浓度69346优化双氧水浓度7035RAMOS癌细胞的测定7136选择性实验714小结72参考文献73结论75致谢77附录攻读硕士学位期间发表的论文目录78独创性声明79关于论文使用授权的说明79第一章绪论肿瘤是一组疾病，对周围的正常细胞来说，细胞无限制的生长是癌症的共同特点，最终形成一个侵犯并破坏正常组织的肿块（肿瘤）。在多数情况下，原发瘤是一个细胞发生的，即所谓来源于一个克隆（CLONE），然而，有时它不仅发生在同一类细胞组织内，而且在不同组织的细胞内可发生多发性原发癌。由于原发瘤的细胞有游走至其他部位及建立新的病灶的能力，故癌细胞可扩散至全身。肿瘤（或称癌症）严重威胁着人类的健康和生命。在我国，它仅次于心脑血管疾病位居死亡原因的第二位，每年约有130万人死于癌症，平均每5个死亡者中就有1人死于癌症。人们对恶性肿瘤普遍存在恐惧心理，对可能治愈缺乏信心。这种恐惧心理的产生与恶性肿瘤治疗效果尚不能令人满意有关。所以，要增强病人与恶性肿瘤斗争的信心，必须从改善其诊断、治疗效果着手，切实做到早期明确诊断，及时进行有效治疗。癌症并非不治之症，应用现代科学技术合理综合治疗，平均5年生存率可达40，早期癌症8090以上可以治愈；中期癌症也有办法进行治疗；即使晚期癌症，其中不少病人也能得到不同程度的控制，缓解症状，延长生命，有些甚至可以治愈。早期明确诊断是及时进行治疗的前提。基于医疗技术的不断提高，现在已使恶性肿瘤病人早期确诊成为可能。但是，我们还应注意到，由于肿瘤症状的潜伏性，尚有不少病人就诊时已属晚期。所以，要病人能得到早期确诊，对于病情的控制和及时的治疗有着很大的帮助，有病及时就医，才不致失去早期确诊的良好时机。1现有肿瘤诊断方法简介11临床诊断对癌症的正确诊断是治疗成功的前提。针对不同的器官和组织的肿瘤病变，有着不一样的临床诊断方法。例如对于乳腺癌的临床诊断分为视诊、触诊、乳腺X射线检查、B超检查。然而最近，一个关于癌症病人的尸检报告充分证明临床的诊断是不够可靠的。在这组材料中，有40的病例临床诊断是错误的。而且误诊和漏诊病例当中绝大多数是最常见的恶性肿瘤。现已知对乳腺患者的腋窝淋巴结转移，临床的印象与病理证实相符合者不超过70。即使是有经验的泌尿科专家，根据临床印象诊断为前列腺的病例中，也会有超过30是错误的。这些例子都突出地表明，只靠临床诊断的判断是极其不准确的，因此必须有其他方法对其进行重复性诊断。当然，为了给深入诊断指出一个大致的方向和范围，先有一个临床的初步考虑还是必须的。12细胞学诊断由于肿瘤细胞较正常细胞容易从原位脱落，故可用各种方法取得瘤细胞和组织颗粒，鉴定其性质。由PAPANICOLAOU所创建的脱落细胞学检查现已经成功地应用于很多部位的检查，特别是对黏膜表面如女性生殖系统或者体腔液的细胞学检查，效果甚佳。细胞学检查对于发现无症状的癌前病变或原位癌非常有用。这种方法作为一种筛选的步骤比作为一种诊断的步骤更加有用，例如，如果病人有恶性肿瘤的典型临床表现及放射性征象，而通过手术切取病例证实所需要的标本有危险时，细胞学诊断就成为了一项不错的选择。细胞学诊断一般包括两种类型。分别是脱落细胞检查、穿刺细胞检查和细胞学诊断分级。其中，脱落细胞检查是一种临床上较为广泛应用的便捷、方便、痛苦小的诊断方法，但是由于取材量小，以单个细胞或少数细胞为观察对象，缺乏组织整体结构，因此阳性率一般比较低，有时还要反复多次取材，在阳性诊断病理组织类型符合率较低，一般为5070，阴性病例不能否定肿瘤的存在。而穿刺细胞检查可用于全身各部位检查，采用不同形状和功能的穿刺针从单纯抽吸取的少量细胞组织碎片到荚、勾、切获取多量组织碎块，其诊断的阳性率和组织类型的正确率均高于脱落细胞学检查。但检查过程中常伴有一定并发症，如出血、气胸，也有个别针道转移甚至死亡的报道。也就是说，细胞学检查报告为“阴性”，并不能排除恶性肿瘤存在的可能性，而细胞学诊断为“阳性”也不能肯定一定是恶性肿瘤，这是因为细胞学检查只是根据一个方面的标准确定是恶性，即核浆异常（NUCLEARCYTOPLASMICABNORMALITIES）。细胞的异型增生甚至出现间变（ANAPLASIA），可能是由于细胞对炎症、放射线或药物治疗特别是烷化剂的反应性改变出现的假象。另一方面，送检标本也有可能不是取自肿瘤的所在部位。13组织学诊断肿瘤组织病理诊断在一定意义上说是决定病人健、残、生、死命运的判决书。基本方法包括常规石蜡切片、冰冻切片、病理报告。当然，也有特殊检查方法，用电子显微镜的超微结构观察。免疫组织化学审查是最近采用与临床的新方法，它是用指示剂（酶或荧光）标记抗体（单克隆和多克隆）。后者对肿瘤抗原定性定位用于对肿瘤抗原性定位，用于肿瘤的诊断和鉴别诊断。但是，由于绝大部分标志物缺乏特异性，分化性差的肿瘤有时不表达有关抗原，间叶肿瘤的多样性和分化的多向性都给诊断和鉴别性诊断带来一定困难。另外还有一种诊断方法叫做肿瘤DNA分析和细胞动力学，它包括流式细胞技术、自显影技术、自动图像分析技术、银染核仁组成区技术、原位核酸分子杂交技术。临床疑为肿瘤的病人，必须有病理学确诊，才能开始疗效。对于浅在的肿瘤，可用简便的方法收集标本，如针吸活检。对于深部的肿瘤，则必需采取大的侦察手术。无论是用针吸活检还是切取活检获取标本，都要先检查取材是否充分，以确保尽可能明确病理诊断的需要。为了确定诊断肿瘤的良恶性质可采用快速冷冻切片检查。组织学诊断需要病理医生和临床医生的密切配合，是综合性考察发病原因以及发病组织情况过程，其中还包括特殊染色、重切或追加切片或请专家会诊等。虽然耗时较多，程序较为复杂，但却是对癌症诊断的有效保证。14内窥镜检查内窥镜可经人体正常孔道插入以检查受检器官内部。可取活体标本，并可吸取其分泌物进行细胞学检查发现肿瘤。多年来内窥镜检查在直肠（直肠镜）、膀胱（膀胱镜）、食道（食管镜）、肺（支气管镜）、胃（胃镜）、腹腔（腹腔镜）及纵隔镜检查时，需做一小块皮肤切口。近年来随着可曲性光导纤维的发展，提高了该检测方法的有效性。是用结肠镜已经可以观察到整个结肠的内面，采用十二指肠镜可观察十二指肠、胆道和胰腺，大大提高了对这些器官肿瘤的诊断1。15影像学检查随着医疗诊断技术的发展，诊断仪器更新，各种影像学检查对肿瘤的诊断起着重要作用。包括X线透视、摄片、造影、断层扫描，超声波检查，放射性核素扫描以及选择性血管造影等等，都可为肿瘤提供确切的定位诊断。放射性平片对于多种组织器官都是一种有价值的检测方法。为了突出显示软组织的细微结构，还经常采用一些特殊的检测方法，例如乳腺癌相术（MAMMOGRAPHY）用于乳腺癌的诊断，颈部空气对比检查（AIRCONTRAST）用于喉癌的诊断。放射线体层照相（LAMINAGRAPHY）有时能更好的显示病变特征，在病人有良好准备的条件下，胃肠道以及泌尿道的放射性照相检查也是非常准确的。血管造影（CONTRASTANGIOGRAPHY）过去只用颅内肿瘤检查，现在由于选择性插管、快速换片以及降低影像技术的问世，它已经能广泛应用于多种疾病的检测。电子计算机轴向体层摄影（CT）在肿瘤诊断中的重要性将会日益增加。16同位素检查目前临床应用的同位素已有多种。脑（锝99M）、骨（氟18、锝99M、锶85）、肝（碘125、碘131）、淋巴结（镓67、铟113M）、甲状腺（碘125、碘131）等器官的病变经常用同位素检查。但是，同位素检查的稳定性尚不太理想，由于许多非肿瘤病变也能出现异常的图像，所以有时提供的检查报告会引起一些混乱。虽然它具有上诉不足，但脑扫描能显示多发性病灶，并且它是无损伤的检测方法，骨扫描对于发现乳腺癌和前列腺癌的隐形骨转移灶比放射性检测的敏感性高。肝、脾扫描对确定器官的大小有特殊的价值，并还常能指出采取活检的最适部位。17生化检查生化检查是根据在身体病变部位，部分生化大分子含量增多，对其进行检测发现含量异常，从而确定可能存在的肿瘤细胞。例如在5羟基吲哚乙酸（5HIAA）和绒毛膜促性腺激素（HCG）的水平显著高于正常水平，可分别诊断类癌和绒毛上皮癌。另外，血清碱性磷酸酶水平异常，尤其是不耐热部分水平异常，提示我们注意肝脏和骨头可能有病变，但不能作为可信的依据。除前列腺癌外的很多疾病，也都有血清酸性磷酸酶含量升高的迹象，而且在已发生转移的前列腺癌患者中，所谓“前列腺馏分（PROSTATICTRACTION）”的检出率也只有6070。尿中5HIAA及香草基杏仁酸（VMA）及其他代谢产物的测定，各自对类癌和神经母细胞的诊断和复诊有一定应用价值。曾有报告中指出，癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白（AFP）的水平与某些病人病体内存在的肿瘤含量有密切的关系，但这些检查的阳性率很低，主要存在含量太低检测不到等问题，这些问题大大局限了对早期癌症定性的可能性。2肿瘤标志物诊断由于关于肿瘤早期的准确诊断具有一定的困难性，特别是内窥镜检查、影像学检查以及大部分临床诊断方法很难在癌症早期有效的做出病变判断，耽误治疗的最佳时机，所以，在现代医学高速发展的今天，对于生化检测方法的研究就显得极其有必要。提高检测方法的灵敏度，降低癌症代谢产物含量的检测限，能在非常大的程度上提高癌症早期诊断的有效性，为患者有效治愈癌症打下坚实的基础。21肿瘤标志物种类肿瘤标志物是指在癌症发生过程中由肿瘤细胞直接合成、分泌及其他组织产生于肿瘤密切相关的活性物质成分，主要以肿瘤相关抗原、癌胚活性蛋白、激素、受体、癌基因及其产物、酶或同工酶形式存在于肿瘤细胞或宿主体液中。目前已发现近100种肿瘤标志物。如表11所示3。表11较常用的肿瘤标志物及其用途TABLE11TUMORMARKERANDTHEAPPLICATIONOFTUMORMARKER肿瘤标志物种类名称主要检测肿瘤酶类谷氨酰转肽酶（GT）甘氨酰脯氨酸二肽氨肽酶（GPOA）5核苷酸磷酸二酯酶同工酶（5NPD）酸性磷酸酶（ACP）乳酸脱氢酶（LDH）神经元特异性烯醇化酶（NSE）原发性肝癌原发性肝癌原发性肝癌前列腺癌恶性淋巴癌小细胞肺癌、胶质癌癌胚类甲种胎儿蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）肝癌、胚源性肿瘤消化道肿瘤蛋白类糖链抗原199（CA199）糖链抗原50CA50糖链抗原125,125CA125,125糖链抗原153CA153糖链抗原724CA724癌糖原211（CYFRA211）前列腺特异性抗原（PSA）组织多肽抗原（TPA）鳞状细胞癌抗原（SCC）胰腺及胆管癌胰腺、胆管及结肠癌卵巢癌乳腺癌乳腺癌非小细胞肺癌前列腺癌乳腺、卵巢及宫颈癌各种扁平上皮癌激素类降钙素（CT）绒毛膜促性腺激素（HCG）甲状腺髓样癌、肺癌绒癌、睾丸癌病毒类EB病毒抗原（IGAVCA,IGAEA）鼻咽癌基因和基因蛋白类BCRABLCERB2RBCSIS慢性髓细胞性白血病乳腺癌视网膜母细胞瘤肺癌这些标志物可用生物化学、免疫组织化学或放射免疫技术测定。理想的肿瘤标志物应具有以下特点对恶性肿瘤有高度特异性；对恶性肿瘤组织类型也具有特异性；能用于肿瘤早期诊断和筛查；标志物含有量能反映肿瘤负荷，因而能作为判断肿瘤预后、评价疗效和检测复发转移的方法。由于迄今尚未找到各种肿瘤的专一特异抗原，因而临床采用的肿瘤标志物和检测方法尚不具备上述要求，只能作为一种重要辅助诊断方法。随着特异性抗原的发现和提纯，利用多种特异性植物凝集素检测肿瘤标志物中的糖蛋白及利用特异性DNA、RNA探针与细胞原位杂交，以检测癌细胞中DNA和RNA序列，分析特异性基因肿瘤标志物的表达等技术的发展，可望找到更为敏感、准确的早期诊断方法。由于目前应用的肿瘤标志物缺乏特异性，为降低假阳性率常采用多种标志物联合检测。如表12所示3。表12肿瘤标志物的联合应用TABLE12THECOMBINEDAPPLICATIONOFTUMORMARKER肿瘤部位选择分析标志物结直肠癌癌胚抗，CA199，CA724胃癌癌胚抗原，CA724肝癌甲胎蛋白，癌胚抗原，CA199，谷氨酰转肽酶卵巢癌CA125,125胰腺癌CA199小细胞肺癌神经元特异性烯醇化酶，SCC非小细胞肺癌SCC,CYFRA211，CREBB2前列腺癌前列腺特异性抗原，酸性磷酸酶乳腺癌CA153，CA724，CREBB2睾丸癌人绒毛膜促性腺激素，甲胎蛋白，癌胚抗原膀胱癌肿瘤多肽抗原，癌胚抗原子宫癌SCC，癌胚抗原，人绒毛膜促性腺激素注CA癌抗原，SCC鳞状细胞癌抗原，CYFRA癌糖原，CSIS（肺癌标志物）22肿瘤标志物诊断对癌症的早期诊断的作用目前，临床上应用于癌症诊断的一般方法和技术都是在已经形成癌症或已经出现癌症症状以后的诊断，而且常常都是非特异性的。有时病灶已经相当大仍不能鉴别其良恶或难以确定其组织学类型。肿瘤标志物诊断则是直接或间接诊断病理性及基因突变与癌相关的基因标志，分析其类型及基因表达状况，其灵敏度和特异性均很高，可以预测肿瘤的发生和判断肿瘤的组织来源，一滴血、一滴尿均可以用来检测，简便快捷，数小时即可以拿到准确的结果。目前，肿瘤标志物诊断的方法主要是基因探针和聚合酶链式反应技术（PCR）。所谓探针就是带有标记物的DNA，它与某个基因上的一般序列相同或互补，因此可以与待测肿瘤基因结合并显示出特殊信号，从而达到基因诊断的目的，这一过程称为核酸分子杂交。所谓聚合酶链式反应就是由特异性引物启动对特异性基因序列的体外酶促扩增技术，它可在数小时内使其一种基因序列复制数百万份，达到肉眼可见的水平，聚合酶链式反应已成为当前肿瘤基因诊断技术领域内的主要武器。随着仪器、试剂的国产化与方法技术的进一步完善，肿瘤标志物诊断将逐步走向临床常规性检查，将对癌症的预防和早期诊断及检测癌症的病程进展、转移、复发发挥重要的作用。3DNA生物传感器31DNA生物传感器基本原理DNA生物传感器是指以DNA为分子识别元件，与相应的换能器结合，实现对特定化学物质的作用并产生相应的可检测信息（如光、电效应、热效应、场效应和质量变化等）2的传感装置。与传统的检测技术方法相比，具有灵敏、快速、无污染、操作简便、分子识别功能等优点，现已成为当今生物传感器领域里的前沿性研究课题。DNA生物传感器和其他生物传感器一样，包含两部分分子识别元件和换能器。在待测物、识别器件以及转化器件之间由一些生物、化学、生化作用或物理作用过程彼此联系。识别元件主要由已知序列的单链寡聚核苷酸片段（即SSDNA探针序列，一般长度在1850个碱基之间）构成，它与被测定的DNA序列（即CDNA目标序列，与DNA探针碱基序列互补）杂交，形成稳定的双链DNA（DSDNA）结构，或者有特殊的核酸适体特异性识别某种活性物质，形成一定结构；换能器则将杂交过程所产生的变化转化为可以观察记录的信号（如电流大小、频率变化、荧光吸收强度等），根据杂交前后信号的变化量，推断出被检测的DNA量，从而实现对特定序列DNA的识别及活性物质的检测。DNA生物传感器的基本原理如图11所示。图11DNA生物传感器原理图FIG11SCHEMATICDIAGRAMOFDNABIOSENSOR32DNA生物传感器的分类DNA生物传感器按换能器件转换信号分类按分子识别器件分类电化学生物传感器DNA修饰电极场离子效应管DNA传感器光学DNA传感器光纤DNA传感器表面等离子体共振DNA传感器光渐消失波DNA传感器化学发光生物传感器荧光DNA生物传感器拉曼光谱式DNA生物传感器光寻址点位式DNA生物传感器压电式DNA生物传感器体波式DNA生物传感器表面声波DNA生物传感器核内/外DNA、CDNA、外源DNA等构成DNA生物传感器不同的检测对象命名的DNA传感器图12DNA生物传感器种类FIG12THETYPEOFDNABIOSENSORWOLFBEIS4认为DNA生物传感器和化学传感器一样，都是基于电化学、光学或压电式传感的原理，按照换能器件转换信号分类原则上可分为电化学式、光学式、压电式三大类。其中电化学式包括电位式、电流式和电导式5，光学式包括吸光式、反光式和发光式。因分子识别元件种类6的不同，分为若干种不同类型及名称的传感器，如图12所示。33DNA生物传感器的传感过程利用DNA传感器测定目标待测物的整个过程通常包括以下4个步骤1SSDNA固定过程。将SSDNA连接或者固定到一个稳定且具有生物相容性的表面，例如固体电极、纳米材料等。2待测物识别过程。将SSDNA修饰表面放入含待测物的溶液中，当与待测物相遇时，SSDNA将识别待测物并形成特定结构，形成的结构在一定条件下稳定存在。3信号的转换过程。即如何将识别信息转化为可测定的信号，如电信号、光信号等。4信号检测过程。不同类型的DNA传感器利用不同的信号性质，按一定的标准和比例，在一定条件下相对应的检测出待测物的含量。例如光学式DNA传感器通常是基于对固定在DNA探针上的光性质标记物进行检测，来达到对目标待测物的检测79。4DNA生物传感器在检测肿瘤标志物方面的应用41核酸适体411核酸适体简介随着人们对分子生物学、基因工程研究的不断深入，特别是人类基因计划的完成，极大的推动了对核酸本身的研究，人们也已经发现核酸的很多其他性质10。例如利用低聚核苷酸间的严格识别的特性而设计并人工合成低聚核苷酸（适体）的出现，使抗体抗原识别发生新的革命性变化，弥补了现有抗体种类不足的缺点11。核酸适体（APTAMER）即“适合”之意，源于拉丁字APTUS。核酸适体通常是一种通过指数富集配基系统进化技术（SELEX）12在体外反复的筛选与扩增，从随机核苷酸序列文库中筛选出来的RNA或单链DNA片段。如图13所示。近年来也出现了通过非指数富集配基系统进化技术得到核酸适体的技术13。核酸适体对靶物质有着高度的亲和性与特异性，能特异地结合金属离子、小分子、多肽、蛋白质、有机染料分子、糖类、活细胞及生物组织等各种配体1417。图13指数富集配基系统进化技术过程12FIG13THEGENERALPROCEDUREFORSELEX核酸适体作为一种新型的分子识别工具，与传统的抗体相比不仅具有高度的相容性与特异性18，还具有靶分子广、易合成、易修饰、稳定性好等优点，在蛋白质研究中显示出了良好的应用潜力。随着SELEX技术的不断丰富和发展，核酸适体作为识别分子在医疗诊断、环境监测、基础分析多种技术中得到广泛的应用19。412核酸适体的识别机理核酸适体与其靶物质之间有高度特异亲和作用，与自然界所有生物分子之间的作用基础一样，即满足生命分子相互作用的两个条件空间和力，这也是近年来筛选各种核酸适体的理论基础。人工构建的寡核苷酸序列文库数量很大，如果随机序列区有N个核苷酸，那么随机序列的多样性就有4N个之多，几乎可以涵盖所有自然界中可能存在的立体构象。在这样一个庞大的寡核苷酸文库中，当与靶分子结合后，单链的寡聚核苷酸形成了在热力学上稳定的空间结构，如发夹假结（PSEUDOKNOT）20、发卡（HAIRPIN）21、G四分体（GQUARTET）22,23、凸环（BULGE）24等特殊的空间结构。在特定的空间结构基础上，核酸适体与其靶分子通过形成氢键、范德华力、疏水键、离子键等作用，形成了紧密而稳定的结构。NGUYEN等人运用磁共振波谱法研究了孔雀石绿与其核酸适体之间的相互作用，发现孔雀石绿在其核酸适体的诱导下产生了电荷分布及构象的变化，从而提示核酸适体与其靶物质之间的识别是二者相互诱导形成的。核酸适体与靶分子的亲和力甚至强于天然的配体，解离常数一般多在1012109MOL/L之间。核酸适体能够分辨出靶分子结构上细微的差别，甚至是一个甲基或一个羟基的差别。如茶碱与其RNA核酸适体的亲和力相当于其类似物如咖啡因与茶碱只相差一个碱基的10000倍25。另外，核酸适体还可以将氨基酸、腺苷等生物小分子的突变体、异构体区分开来2629。这些特点都大大地提高了传感器的选择性。413核酸适体在生物传感器领域的应用图14适体在生化分析领域的广泛应用30FIG14WIDESPREADUSEOFAPTAMERSFORNUMEROUSANALYTICALANDBIOLOGICALAPPLICATIONS从1990年以来适体被第一次报道出来3032到近两年来适体已经被广泛应用于生化分析的许多方面，如图14所示。它不仅弥补了与抗原抗体的缺点，而且再提高检测灵敏度方面卓见成效。特别是在DNA生物传感器方面，其应用也已经报道了许多，这类基于适体的生物传感器叫做“适体传感器（APTASENSORS）”33。ZHOU等人描述了基于适体的分子识别对生物传感器的帮助，文中提到核酸适体的分子识别单一性，为检测生物分子的选择性提供了巨大的帮助34。LI等人描述了一类免标记和免底物的适体传感器，这种传感器有区别于许多荧光传感器，并向我们展示了更多适体传感器的优点35。FAN等人则设计了一类靶应答开关，这类开关以适体作为基础，大大提高了核酸生物传感器的选择性和灵敏度36。TAN等人总结了核酸适体在生物传感器和生物化学分析方面的应用，它们通常有三种思路设计，第一种叫做CDNA结构开关思路，如图15（A）所示；第二种叫做酶中间体思路，如图15（B）所示；第三种叫做DNAZYME中间体思路，如图15（C）所示37。图15三种基于适体的生物传感器基本范例设计原理图37FIG15GENERALSCHEMATICOFTHREEBASICPARADIGMSUSEDINTHEDESIGNOFAPTAMERBASEDBIOSENSORS42纳米材料在DNA生物传感器中的应用随着纳米管、纳米棒、纳米束和纳米线的不断出现，纳米技术已成为科技界的重要关注点3842。正如美国IBM公司首席科学家ARMSTRONG所说“就像20世纪70年代微电子技术产生了信息革命一样，纳米科技将成为下一世纪信息时代的核心。”纳米科技的迅速发展，渗透到不同学科，产生了许多新的研究领域，带动许多相关课题的产生。由于纳米粒子具有优良的光学性、电学性和生物亲和性，使其在生物分子的分析检测方面越来越受到人们的关注，现在己经成为分析化学的一个重要研究热点43。421纳米粒子的性质纳米粒子由颗粒尺度为纳米数量级，粒径一般在1100NM，处在原子簇和宏观物体交接区域内的粒子（又称超微粒子、纳米颗粒、量子点等）组成。纳米微粒结构即不同于单个的原子，也不同于体块材料，具有一些新异的化学物理特性，涉及到大块样品中所忽略的，或根本不具有的一些化学、物理问题，从而产生一些优越于传统材料的特殊性能。有五种效应形式第一，体积效应。也称为小尺寸效应，是由于颗粒尺寸变小而引起的宏观物理性质的变化44。当纳米粒子的尺寸与传导电子的波长及超导态的相千波长等物理尺寸相当或更小时，周期性的边界条件将被破坏，熔点、磁性、光吸收、热阻、化学活性、催化性等与普通粒子相比都会有很大变化。第二，表面效应。指纳米粒子表面原子数与总原子数之比随粒径变小而急剧增大后所引起的性质上的变化。因为粒径越小，位于表面的原子数越多，表面原子数越多，表面原子配位数就不足，所以粒子的直径逐渐接近原子的直径时，随着粒径的减小，纳米粒子的比表面积、表面能和表面结合能都会急剧增大，存在许多未饱和键特别容易吸附其它原子或与其他原子发生化学反应而稳定下来，从而其表面具有很高的化学活性，在应用上主要表现为能有效的增大比表面积。第三，量子尺寸效应。当纳米粒子的尺寸下降至一定值时，金属粒子费密能级附近的电子能级由准连续变为离散能级，并且纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据的分子轨道能级和最低未被占据的分子轨道能级，使得能隙变宽的现象。当纳米粒子尺寸与光波波长，德布罗意波长，超导态的相干长度或与磁场穿透深度相当或更小时，晶体周期性边界条件将被破坏，非晶态纳米微粒颗粒表面层附近的原子密度减小，导致光、声、电、磁、热力学等特性出现异常，如超导相向正常相转变，增强微波吸收等。久保理论就是量子尺寸效应的典型例子45。第四，催化性质。纳米粒子晶粒体积小，比表面积大，表面活性中心多，其催化活性和选择性大大高于传统催化剂。而且，纳米晶粒催化剂没有孔隙，可避免使用常规催化剂所引起的反应物向孔内扩散带来的影响。纳米催化剂不必附着在惰性载体上使用，可直接放入液相反应体系中。第五，宏观量子隧道效应。量子隧道效应是从量子力学的粒子具有波粒二相性观点出发，解释微观粒子贯穿势垒的能力称为隧道效应。近年来，人们逐渐发现了一些宏观量，如微粒磁化强度、量子相干器件中的磁通量以及电荷等也具有穿越宏观系统的势垒而产生变化的隧道效应宏观量子隧道效（MICROSCOPIOQUANTUMTUNNELING）46，用此概念可定性解释超细镍微粒在低温下继续保持超顺磁性。AWSCHALOM等采用扫描隧道显微镜技术控制纳米尺度磁性纳米粒子生成，用量子相干磁强计研究低温条件下微粒磁化率对频率的依赖性，证实了低温下的确存在磁的宏观量子隧道效应47。422纳米粒子标记DNA探针在生物传感器中的应用由于纳米粒子具有优良的生物相容性，使其在DNA标记分析中应用广泛，在疾病诊断、DNA检测等方面有着非常好的应用前景。金纳米粒子可与氨基发生非共价的静电吸附而牢固结合，与巯基之间形成很强的AUS共价键48，这使得胶体金可与生物活性组分结合，形成的探针用于生物体系的检测过程中。MIRKIN等人49建立了基于金纳米粒子标记的DNA探针，并以银沉积作为增强元素来改善测量中导电性变化的电化学DNA生物传感器50。基于纳米粒子的优化和AG沉积的信号放大，此方法的灵敏度比传统的荧光体系检测法提高了100倍，其检测限达500FMOL/L。设计原理如图16所示。图16DNA检测的工作原理图50FIG16SCHEMATICDIAGRAMOFDNADETECTIONOZSOZ等以纳米金标记寡核苷酸作为探针，与固定在笔式电极上的互补DNA杂交，制备了重现性和稳定性良好的电化学DNA传感器，检测限达078FMOL/L51。WANG等人利用电化学方法检测纳米金标记DNA，他们以磁性纳米粒子为DNA探针的固相载体，依次组装上生物分子，形成抗生素生物素DNA生物素抗生素纳米金的复合物，对复合物上的纳米金进行溶解后用计时电位法进行分析，实现对待测DNA的定量检测52。他们还以纳米CDS为标记物检测DNA的杂交，采用电位溶出分析的方法对溶解出的CD2进行测定。由于结合了磁场分离和高灵敏的电化学检测，使得检测限可达100FMOL/L53。WANG等还利用电化学译码技术（CODINGTECHNOLOGY），结合CDS、ZNS、PBS三种纳米粒子的电化学溶出检测，同时测定多个DNA目标分子，为多种DNA的序列检测提供了一个新思路54。WANG等人利用包埋法制备的电活性物质醛基二茂铁功能化的聚苯乙烯微球为DNA探针的固相载体，计时电位法检测醛基二茂铁的电化学信号，进行DNA序列的测定55。FANG等人以纳米银标记寡核苷酸为探针，通过阳极溶出伏安法测定AG的含量，以达到测定待测DNA的目的，从而建立了高灵敏的电化学检测DNA的方法56。他们还合成了一种新的CU/AU核壳型纳米粒子，并将其应用于大肠杆菌毒素基因分析中，检测大肠肝菌毒素DNA的下限为50PMOL/L57。LI等人制备了氨丙基三乙氧基硅烷功能化的FE3O4磁性纳米材料，并将其修饰在石墨电极上用于DNA的固定，利用循环伏安法检测目标DNA的量58。HANSEN等人将CDS、ZNS、PBS三种不同的金属硫化物纳米粒子用于特定序列DNA的电化学检测中，构建了DNA检测的新方法，检测限可以达到FMOL/L级59。WILLNER等人为使结合在电极上的亚甲基兰的电化学信号得到激活，而将错落交叉连接的AU纳米粒子聚集在电极表面来为其提供一种传导矩阵，从而实现了DNA的电化学放大检测60。FAN等人将捕获DNA探针固定在金电极上，并以目标DNA序列将标记了金纳米粒子的信号DNA探针连接在一起，形成“三明治”型的结构，研究出一种新型的基于纳米粒子的电化学DNA检测方法61。利用金纳米粒子与DNA序列之间的相互作用，金纳米粒子也被作为色度指示剂用于核酸适体的检测6264。43DNA生物传感器的检测手段431电化学检测技术4311电化学传感器目前，用于分析目的的电化学测量有两大类，一类是可以在电极体系处于平衡的条件下测量的电势传感器；另一类是有电流通过的非平衡条件下的电流传感器（或伏安传感器）。电势传感器是指由指示电极和溶液中的参比电极与电位差计或高阻抗的伏特表相连构成的电化学测试系统。在经典的电势传感器中，有一种比较普遍的测定方法叫做电势滴定，它是指任何包含滴定和被滴定组分活度或浓度变化的滴定。主要应用于酸碱滴定、沉淀滴定、络合滴定、氧化还原滴定。其原理严格按照NERNST方程。在此基础上，人们研究了选择性电极、玻璃电极、PH计、离子选择性固态膜电极和中性膜电极等6570。这些传感器已经应用于许多经典的滴定检测当中，其灵敏度和选择性极好，大大提高了检测的准确性。电流传感器是在固定电势的情况下测定电流，并记录一系列与电势