系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞ikzf1基因mrna表达研究（可编辑）

安徽医科大学硕士学位论文系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞IKZF1基因MRNA表达研究姓名胡文龙申请学位级别硕士专业皮肤病与性病学指导教师张学军杨森20100401安徽医科大学硕士学位论文中文摘要系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞IKZF1基因MRNA表达研究研究背景系统性红斑狼疮SLE是一种临床表现多样化、可累及多个系统的自身免疫性疾病。SLE发病机制尚未明确,是一种多基因病,目前认为与遗传、免疫、病毒感染、药物及激素等因素有关,其中遗传因素在SLE的发病中发挥重要作用。过去二十年,各研究小组主要通过全基因组扫描和候选基因的方法研究SLE的易感基因,但多数结果不尽一致。在线人类孟德尔遗传OMIM数据库收录的13个SLE易感基因位点中有11个是通过连锁分析和全基因组扫描发现的,分别是1Q4142SLEB1,2Q373SLEB2,4P16152SLEB3,12Q24SLEB4,13Q32SLEB5,16Q112SLEB6,20P12SLEB7,20Q131SLEB8,1Q32SLEB9,7Q32SLEB10,2Q322Q323SLEB11。通过精细定位和候选基因的方法发现了一些可能与SLE相关的易感基因,如PTPN22,CRP,FCGR2A,FCGR3A,FCGR2B、STAT4,IRF5,TLR5,ITGAMITGAX,FAS,PARP,PDCD1,HLADRB1,C2,C4等。近年来随着国际单体图型计划HAPMAP的完成和廉价高效的高通量基因分型技术的出现,全基因组关联分析GWAS已成为寻找复杂疾病易感基因最有效的方法。最近用GWAS在汉族人群中研究发现了九个新的易感基因及位点,其中包括IKZF1SNPRS4917014与SLE显著相关OR072,95CI068077,P2751023。在功能方面IKZF1编码的转录因子IKAROS在淋巴细胞的的发生、发育、分化、增殖等方面起着重要的作用。目的IKZF1基因MRNA表达在SLE患者的外周血单个核细胞PBMCS中的表达4安徽医科大学硕士学位论文是否异常,该基因MRNA表达与SLE活动指数SLEDAI是否相关以及RS4917014与IKZF1MRNA表达之间的关系。方法利用实时荧光定量PCR技术,在60例SLE患者和60例正常对照外周血单个核细胞中检测IKZF1MRNA表达状况应用SEQUENOMMASSARRAY技术对60例SLE患者IKZF1基因中的RS4917014位点进行基因分型,用SPSS100软件对数据资料进行统计分析。结果SLE患者外周血单个核细胞IKZF1MRNA表达明显低于对照组P001IKZF1MRNA表达与SLEDAI及RS491701无相关性。结论IKZF1基因可能与SLE的发病机制有关。关键词红斑狼疮,系统性IKZF1外周血单一核细胞RTPCR5安徽医科大学硕士学位论文ABSTRACTSTUDYONMRNAEXPRESSIONOFIKZF1GENEINPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLSOFSLEPATIENTSBACKGROUNDSYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSSLEISANAUTOIMMUNEDISEASEINVOLVINGMULTIPLESYSTEMSANDORGANSITSPATHOGENESISHASNOTBEENENTIRELYELUCIDATEDSLEISAPOLYGENICDISEASE,WHICHISRELATEDWITHGENETIC,IMMUNE,VIRALINFECTIONS,DRUGS,HORMONESANDSOONGENETICFACTORSMAYPLAYANIMPORTANTROLEINTHEPATHOGENESISOFSLEINTHEPASTTWODECADES,MANYGROUPSHADIDENTIFIEDSUSCEPTIBILITYGENESBYGENOMEWIDESCANNINGANDCANDIDATEGENESTUDYHOWEVER,MOSTRESULTSWERENOTCONSISTENTONLINEMENDELIANINHERITANCEINMANOMIMEMBODIES13SLESUSCEPTIBILITYLOCITHEREARE11LOCIWHICHHAVEBEENFOUNDBYLINKAGEANALYSISANDGENOMEWIDESCAN1Q4142SLEB1,2Q373SLEB2,4P16152SLEB3,12Q24SLEB4,13Q32SLEB5,16Q112SLEB6,20P12SLEB7,20Q131SLEB8,1Q32SLEB9,7Q32SLEB10,2Q322Q323SLEB11WEHAVEFOUNDANUMBEROFSUSCEPTIBILITYGENESBYFINEMAPPINGANDCANDIDATEGENEAPPROACH,INCLUDINGPTPN22,CRP,FCGR2A,FCGR3A,FCGR2B,STAT4,IRF5,TLR5,ITGAMITGAX,FAS,PARP,PDCD1,HLADRB1,C2ANDC4INRECENTYEARS,ASTHEINTERNATIONALHAPMAPPROJECTHASBEENFINISHEDANDLOWERCOST,HIGHLYEFFICIENTANDHIGHTHROUGHPUTGENOTYPINGTECHNOLOGIESAREAPPEARING,GENOMEWIDEASSOCIATIONSTUDYGWASHASBECOMETHEMOSTEFFECTIVEMETHODTOSEARCHFORSUSCEPTIBILITYGENESOFMULTIFACTORIALDISEASERECENTLY,WEHAVEIDENTIFIEDNINENEWSUSCEPTIBILITYLOCIINCLUDINGIKZF1,SNPRS4917014ASSOCIATIONWITHSLEOR072,95CI068077,P2751023INCHINESEHANPOPULATIONBYGWASBIOLOGICALLY,THEIKZF1GENEENCODESTHELYMPHOIDTRANSCRIPTIONFACTORIKAROSWHOSE6安徽医科大学硕士学位论文FUNCTIONISREQUIREDFORDEVELOPMENTOFALLLYMPHOIDCELLSOBJECTIVEWESTUDYIKZF1MRNAEXPRESSIONLEVELSINPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLSOFSLEPATIENTS,ANDEXPLOREWHETHERTHEIKZF1EXPRESSIONISASSOCIATEDWITHTHEVARIANTOFTHESNPRS4917014ANDSLEDAIMETHODSFLUORESCENTQUANTITATIVEREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTIONRTPCRWASUSEDTOEXAMINETHEEXPRESSIONOFIKZF1MRNAINPBMCSIN60SLEPATIENTSAND60CONTROLSSEQUENOMMASSARRAYSYSTEMWASUSEDTOGENOTYPESINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISMRS4917014IN60CASEOFSLEAND60NORMALCONTROLSTHESPSS100SOFTWAREWASUSEDFORSTATISTICALANALYSISRESULTSTHEEXPRESSIONLEVELSOFIKZF1MRNASINSLEPATIENTSWERESIGNIFICANTLYDECREASEDTHANTHOSEINHEALTHYCONTROLSP001NORELATIONSHIPWASFOUNDBETWEENIKZF1MRNAEXPRESSIONLEVELSANDSLEDAISCORESORSNPRS4917014CONCLUSIONITSUGGESTSTHATEXPRESSIONOFIKZF1MRNAMAYBECORRELATEDWITHTHEPATHOGENESISOFSLEKEYWORDSLUPUSERYTHEMATOSUS,SYSTEMIC/IKZF1/PERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLS/RTPCR7安徽医科大学硕士学位论文英文缩略词表缩写词SLEOMIMSLEDAIPBMCSGWASSNPEDTAORCIPCRSAP英文全称SYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSONLINEMENDELIANINHERITANCEINMANSLEDISEASEACTIVITYINDEXPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLSGENOMEWIDEASSOCIATIONSTUDYSINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISMETHYLENEDIAMINETETRAACETEODDSRATIOCONFIDENCEINTERVALPOLYMERASECHAINREACTIONSHRIMPALKALINEPHOSPHATASE中文名称系统性红斑狼疮人类在线孟德尔遗传系统性红斑狼疮活动性指数外周血单个核细胞全基因组关联分析单核苷酸多态性乙二胺四乙酸优势比可信区间聚合酶链反应虾碱酶RTPCRREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAIN逆转录聚合酶链反应REACTIONARAMAFLDAMERICANRHEUMATISMASSOCIATIONMINORALLELEFREQUENCYLINKAGEDISEQUILIBRIUM美国风湿病协会最小等位基因频率连锁不平衡3学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名日期学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版,有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅,有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索,有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交中国博士学位论文全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国学位论文全文数据库中全文发表,并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版,并同意编入CNKI中国知识资源总库,在中国博硕士学位论文评价数据库中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名日期导师签名日期安徽医科大学硕士学位论文系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞IKZF1基因MRNA表达研究硕士研究生胡文龙导师张学军杨森1引言系统性红斑狼疮SLE是一种以自身抗体产生和免疫复合物形成为特点的自身免疫性疾病,自身抗体和免疫复合物IMMNNECOMPLEXES,ICS的沉积可引起多器官的炎症和损伤,SLE的临床表现各异,包括肾小球肾炎、皮炎、血栓形成、血管炎、癫痫发作、关节炎等。目前SLE发病机制尚不完全清楚,遗传与环境因素均起重要作用,但一般认为环境因素仅在一定的遗传背景下致病。SLE主要侵犯育龄期妇女,且存在明显的性别差异,男女之比约为19,在不同的种族发病率有所不同非白种人发病率高。SLE患者的同胞或子女患病风险明显增加,SLE的同胞的患病风险是一般人群的20倍,但不符合孟德尔遗传规律。SLE双生子研究结果显示,单卵双生比率为29,而同卵双生比率为29571,2。以上均表明遗传因素在SLE发病中发挥重要作用。随着国际人类基因组单体型图计划HAPMAP的完成和高通量基因分型技术的发展,为寻找SLE易感基因提供了更加有效的方法。最近,我们应用全基因组关联分析研究发现了中国人群系统性红斑狼疮9个新的易感基因/易感位点,其中包括IKZF1基因。该研究发现SNPRS4917014与SLE显著相关OR072,95CI068077,P2751023。该点位于IKZF1基因5端的上游,在该点所在的LD区域只有IKZF1基因3。8安徽医科大学硕士学位论文IKZF1基因在人类位于7P122,编码的蛋白是IKAROS,其生物学功能主要是作为淋巴细胞转录因子,调节淋巴细胞的发生、发育、分化、增值等。该基因包括7个外显子,通过选择剪切至少可产生8种亚型IK1,IK2,IK3,IK4,IK5,IK6,IK7和IK84,不同的亚型N端锌指序列的数目为14个不等,而只有N端包含3个或4个锌基序列的IKAROS的亚型IK1,IK2和IK3才可以与IKAROS家族共同的DNA结合位点“5GGGAA23”结合,进而激活目标基因的转录而那些N端少于3个锌指结构的亚型IK4,IK5,IK6,IK7和IK8不能与DNA结合,在转录中以显性负相的方式抑制有活性的亚型与DNA结合。所有的IKAROS亚型C端含有两个相同的锌指序列,其作用是与其他的IKAROS或其家族的其他蛋白形成同二聚体或异二聚体,发挥不同的功能57。IKAROS在人类的免疫调节方面起重要的调节作用,可调节淋巴细胞的分化、增殖和自身的免疫耐受8本课题组先前的GWAS研究发现IKZF1基因与中国汉族人群SLE的发病有关3。本研究主要应用实时定量PCR来研究SLE外周血单个核细胞IKZF1基因MRNA的表达水平及其与SLE疾病活动之间的关系,同时研究SNPRS4917014是否影响该基因MRNA的表达。2实验材料与方法21研究对象病例组60例SLE患者均符合美国风湿病协会ARA1997年修订的SLE诊断标准。疾病活动程度按照1992年制定的系统性红斑狼疮活动性指数SLEDISEASEACTIVITYINDEX,SLEDAI进行评定。对照组60例健康对照来自在本院皮肤科门诊就诊的无自身免疫性疾病和系统性疾病的非SLE患者,同时要求一、二、三级亲属中也均无自身免疫性疾病。所研究对象之间无亲缘关系且均为汉族人,病例组与对照组在性别与年龄上相匹配。研究对象一般情况见表1。9安徽医科大学硕士学位论文表1研究材料一般情况TAB1BASICSTATEOFSLEPATIENTSANDCONTROLS组别病例正常对照N6060平均年龄岁3463124631251046男/女0/600/6022实验试剂221淋巴细胞分离试剂1淋巴细胞分离液合肥志宏生物技术公司2磷酸盐缓冲生理盐水PBS3TRIZOL液合肥志宏生物技术公司222RNA提取试剂1K1622逆转录RT试剂盒合肥志宏生物技术公司2异丙醇蚌埠化学试剂厂375乙醇蚌埠新科电化试剂厂4氯仿蚌埠新科电化试剂厂223实时荧光定量RTPCR试剂1RTPCR试剂盒大连宝生物工程有限公司2TAQMAN探针大连宝生物工程有限公司224DNA提取试剂1基因组DNA提取试剂QIAGENDNA抽提试剂盒250,包括FG1细胞裂解缓冲液,FG2蛋白变性缓冲液,FG3DNA溶解缓冲液,QIAGEN蛋白酶2异丙醇蚌埠化学试剂厂375乙醇蚌埠新科电化试剂厂225电泳试剂1超纯水2TRIS碱上海生工生物工程公司10安徽医科大学硕士学位论文3硼酸上海生工生物工程公司4TRIS硼酸电泳缓冲液TBE浓贮存液每升,554GTRIS碱,275G硼酸,20ML05MOL/LEDTAPH80使用液,050045MOL/LTRIS硼酸,0001MOL/LEDTA5琼脂糖PROMEGA公司,USA6溴化乙锭,10MG/ML贮存液上海生工生物工程公司226DNA标准化试剂1FG3DNA溶解缓冲液2超纯水227基因分型试剂2271PCR反应相关试剂1去离子水2一套05M扩增引物和延伸引物混合物上海赛百胜基因技术有限公司合成310XPCR缓冲液SEQUENOM公司415MM和25MMMGCL2SEQUENOM公司525MMDNTP混合物SEQUENOM公司65U/L热启动TAQ酶SEQUENOM公司2272制备SAP相关试剂1去离子水2SAP缓冲液SEQUENOM公司3SAP酶17U/LSEQUENOM公司2273IPLEX延伸相关试剂1去离子水2IPLEX阳性缓冲液SEQUENOM公司3IPLEX终止混合物SEQUENOM公司4IPLEX延伸引物混合物SEQUENOM公司11安徽医科大学硕士学位论文5IPLEX酶SEQUENOM公司23实验仪器231淋巴细胞分离器材1MICROTEC1542R低温高速离心机日本2HAIER20冰柜中国海尔集团公司3EDTAK2或EDTANA2抗凝真空管415ML离心管515MLEP管650ML试管架71001,000LTIPQUALITYSCIENTIFICPLASTIC,USA82001,000L移液器EPPENDORF,GERMANY9一次性塑胶手套232RNA提取器材1MICROTEC1542R低温高速离心机日本2HAIER20冰柜中国海尔集团公司3192型超低温冰箱80三洋公司,日本4MSIMINISHAKER振荡器马来西亚5BS60型电热恒温水浴箱北京市医疗设备厂615MLEP管702MLEP管80510L、20200L、1001,000LTIPQUALITYSCIENTIFICPLASTIC,USA90125L、0550L、50200L、2001,000L移液器EPPENDORF,GERMANY10一次性塑胶手套233实时荧光定量RTPCR器材1MICROTEC1542R低温高速离心机日本2BS60型电热恒温水浴箱北京市医疗设备厂12安徽医科大学硕士学位论文3192型超低温冰箱80三洋公司,日本4HAIER20冰柜中国海尔集团公司5192型超低温冰箱80三洋公司,日本615MLEP管702MLEP管80510L、20200L、1001,000LTIPQUALITYSCIENTIFICPLASTIC,USA90125L、0550L、50200L、2001,000L移液器EPPENDORF,GERMANY10一次性塑胶手套234DNA提取器材1MSIMINISHAKER振荡器马来西亚2MICROTEC1542R低温高速离心机日本3BS60型电热恒温水浴箱北京市医疗设备厂4192型超低温冰箱80三洋公司,日本5HAIER20冰柜中国海尔集团公司6美菱BCD238型冰箱中国美菱集团公司70510L、20200L、1001,000LTIPQUALITYSCIENTIFICPLASTIC,USA80125L、0550L、50200L、2001,000L移液器EPPENDORF,GERMANY915ML离心管QSP10EDTAK2或EDTANA2抗凝真空管1150ML试管架12摇床TY80R235电泳仪器1MSIMINISHAKER振荡器马来西亚2MICROTEC1542R低温高速离心机日本3TGRADIENTTHERMOCYCLERBIOMETRA,GERMANY4DYY型电泳槽北京市六一仪器厂13安徽医科大学硕士学位论文5ELECTRONICUVTRANSILLUMINATORAAB,USA6FD201稳压稳流电泳仪北京通用分析仪器厂7TN100B型托盘式扭力天平上海第二天平仪器厂8TANON3500全自动数码凝胶成像系统上海天能科技有限公司9HAIER20冰柜中国海尔集团公司100125L、0510L、20100L、50200L、2001,000L移液器EPPENDORF,GERMANY110510L、20200L、1001,000LTIPQUALITYSCIENTIFICPLASTIC,USA1205ML、15ML离心管QSP236DNA标准化仪器1全波长紫外/可见光扫描分光光度计NANODROP1000NANODROP公司,USA2DNA浓缩仪EPPENDORF,CONCENTRACTOR5301237基因分型仪器1MASSARRAY系统SEQUENOM公司296孔、384孔PCR板托垫34306311型封板膜PERKINELMER公司4SEALROLLER滚筒PERKINELMER公司5通用型压板机PERKINELMER公司6136881D垂直混匀器FISHER公司7通用型VBOTTOM洗板机8通用型加样槽9通用型托盘天平10VBOTTOMBIORAD384孔PCR储放板BIORAD公司11TF0384型384孔PCR板ABGENE公司12移液器单道0125L、0510L、20100L、50200L、2001,000L,12道0510LBIOTECH公司14安徽医科大学硕士学位论文1310L、200L、1,000LTIPAXYGEN公司1415ML、2MLEP管AXYGEN公司15隔离衣16一次性口罩、帽子、塑料鞋套和塑胶手套24分析软件和电子数据库查询信息1逆转录引物和探针设计软件PRIMER501引物设计软件ASSAYDESIGNER302美国国立生物技术信息中心/03网上在线孟德尔遗传/NIHGOV/OMIM/4GENEBANK/5HAPMAPPROJECTLDDATABASE/6SEQUENOM引物合成/25实验方法和步骤251淋巴细胞分离步骤2511全血标本和临床资料的采集本研究采用统一设计的SLE遗传流行病学调查表和正常对照调查表,由经过专门培训的流行病学调查员对患者和正常对照进行问卷调查。调查表内容包括一般情况姓名、性别、年龄等、发病年龄、有无家族史、发病季节、发病部位发病的一般情况等。经调查对象知情同意,采集外周静脉血5ML,放置于5MLEDTANA2抗凝管中。2512淋巴细胞分离步骤1在15ML塑料离心管中预先加入4MLFICOLL淋巴分离液。2小心的将稀释后的血液加到FICOLL淋巴分离液的上面。3室温2600RPM离心20分钟。4取出离心管,小心吸出中间白白的那一层,重悬于5倍体积的PBS中,混匀。5室温2000RPM离心10分钟。15安徽医科大学硕士学位论文6弃去PBS,剩下50UL左右,混匀细胞,加1MLTRIZOL试剂,吸入15MLEP管中。7将EP管放入20冻存。252RNA提取步骤1解冻将装有淋巴细胞的15MLEP从20低温冰箱取出放置4冰箱解冻24小时。2用DEPC水配75的乙醇,放20预冷。3向装有淋巴细胞的15MLEP管加入02ML氯仿,颠倒混匀10下,放室温5分钟,412000G离心15分钟。4另取15MLEP管边侧贴样本号标签并用透明胶带包裹,同时用记号笔在管盖标明。5离心结束后转上层水相约400L于对应的15MLEP管中,加等体积异丙醇约400L,混匀室温10分钟,412000G离心,10分钟。6离心结束后,弃上清加冰预冷的75乙醇1ML,47500G离心,5分钟。7离心结束后弃上清,空气干燥510分钟,加入20LDEPC水,然后60水浴10MIN。8电泳及测浓度后放20备用。253实时荧光定量RTPCR步骤2531CDNA制备步骤1取11L于02MLEP管中,放PCR仪705MIN,然后放置冰上3MIN。2每个EP管中依次加入相应RNA11L,5BUFFER4L,INHIBITOR1L,10MMDNTP混合物2L,MMLV1L,配成2L0放入PCR仪。3扩增PCR反应程序42709541H5MIN2MIN4加入80LDDH2O,20保存CDNA。2532CDNA检测步骤及注意事项16安徽医科大学硕士学位论文1取02EP管,用记号笔在管盖标明。2每个EP管中依次加入相应CDNA2L,10BUFFER1L,MGCL206L,10MMDNTP混合物16L,上游引物02L,下游引物02L,TAQ酶01L,H2O43L,配成10L体系放入PCR仪。3扩增PCR反应程序94945MIN30SEC557272430SEC1MIN10MIN35CYCLES4配置1琼脂糖凝胶,加入PCR产物电泳。2533逆转录引物和探针的设计1用PRIMER50软件设计引物和探针见表2。表2引物和探针序列TAB2PRIMERANDTAQMANPROBESEQUENCES基因IKZF1GAPDH引物序列FORWARD5CCTGGAACAGCGGGATCAREVERSE5CCATTGCTCATCAACAACTTCTTGFORWARD5CCACATCGCTCAGACACCATREVERSE5GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT探针序列TAQMAN5FAMAGAGGCTGCGGGAGGAAAATTTGGAECLIPSETAQMAN5FAMCAAATCCGTTGACTCCGACCTTCACCTTECLIPSE2引物和探针均由宝生物公司合成。2534实时荧光定量步骤1取384孔板。2每个孔中依次加入2PREMIXEXTAQTM10L,IKZF1上、下游引物各04L或GAPDH上、下游引物各04L,50ROXREFERENCEDYE04L,TAQMAN探针04L,CDNA1L,DH2O灭菌蒸馏水74L,每个样本重复3孔。3PCR反应程序17安徽医科大学硕士学位论文959510SEC10SEC60440SEC40CYCLES4将标准品10倍连续梯度的标准曲线。5测定IKZF1和GAPDH的拷贝数。254基因组DNA的制备2541基因组DNA提取步骤1基因组DNA提取步骤用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒按照产品操作说明书提取样本基因组DNA,步骤如下1细胞解冻将血标本从80冰箱取出,放置在20低温冰箱24小时,再从20低温冰箱取出放置4冰箱解冻24小时。2在20MLEP管边侧贴样本号标签并用透明胶带包裹,同时用记号笔在管盖标明。3吸取10MLFG1于上述管中,取400L血样加入对应EP管中,颠倒混合2030次,直至无血凝块出现,16,000转/分离心4分钟离心期间配置FG2/QIAGEN蛋白酶混合液,需现配现用。4小心倾倒上清,吸水纸沥干30秒后加入FG2/QIAGEN蛋白酶溶液200L,每加入一份需立即震荡混匀,直到无细胞团出现,待全部加完后仔细检查是否有裂解不完全的样本。如有,应彻底震荡完全。5短暂离心后,65水浴20分钟,水浴时需将管口1/3左右留在液面以上,以防止加热引起管盖打开,水分等杂质进入管内。6短暂离心后,加入200L异丙醇,上下颠倒数次,可见絮状DNA沉淀,如发现管内有黑绿色团块,需用力摇动,将团块摇成澄清液。716,000转/分离心4分钟,小心倾倒上清,吸水纸沥干30秒,可见管底有白色18安徽医科大学硕士学位论文DNA沉淀。8加入200L75乙醇,小心弹起片状沉淀,16,000转/分离心5分钟。9小心倾倒上清,吸水纸沥干20秒,加入110LFG3,65水浴20分钟,置于摇床上12小时,电泳及测浓度后,置80冻存DNA。2542DNA浓度标准化1准确测定每份待标准化样本DNA的浓度。2建立电子表格,在每个96孔板上留有A1,H12的空白对照、A6的板内对照和H6的板间对照。3按照电子表格的顺序,加入已经测定浓度的DNA,如DNA浓度高于1525NG/L则加入适量FG3如DNA浓度低于1525NG/L,则使用真空浓缩仪浓缩样本DNA,最终使得每一孔浓度均在1525NG/L之间,且OD值在1820之间。4离心后贴上粘性锡箔纸,并用标记笔标上样本板标号、样本类型、来源地等信息。5在平板离心机上,3,000G离心3分钟,存放于20冰柜中备用。255SNP点选择本实验选取了HAN等3在中国汉族人群中GWAS研究发现的与SLE相关的SNPRS4917014OR072,95CI068077,P2751023,该SNP位于IKZF1基因的上游,并且在该点所在的LD区域只有IKZF1基因。256DNA引物设计及合成2561基因序列的获取1在MYSEQUENOM网站中注册成用户。在NCBI网页/SNP位点的名称RS4917014,按照DBSNPBATCHREPORTOR格式显示。2将SNP点所在序列发送到MYSEQUENOM网站注册的邮箱中。3在MYSEQUENOM网站的TOOLS工具栏中选择GENOTYPING。4点击RSFORMAT,在BROWSE按钮中选择NCBI网站发送到邮箱的文件。19安徽医科大学硕士学位论文5678网站对序列的格式化完成后在SENTTO栏中,选择PROXSNP。开始PROXSNP,点击BEGINSTART。上述步骤完成后,在SENTTO栏中选择PREXTEND。开始PROXSNP,点击BEGINSTART。9在产生的结果中,选择OUTPUT,并把文件内容复制在新的TXT文件中2562结合文献并采用ASSAYDESIGNER30软件进行引物设计1在软件SNPGROUP栏中选择BROWSE按钮,找到上述产生的TXT文件。2在AASSYDESIGN栏中选择SBEMASSEXTEND,并在SBESTOPMIX栏中选择IPLEX,在MULTIPLEXLEVEL中按照实际情况选择不同的反应重数。345SNPCAPTURE,EXTENDPRIMERDESIGN,MASSMULTIPLEXING均选择默认参数。参数设定后,点击RUN。在TXT文件目录相应位置找到产生的引物序列文件,设计的引物序列见表3。表3RS4917014位点引物序列TAB3PRIMERSEQUENCESOFRS4917014项目扩增引物1ST扩增引物2ND延伸引物序列5ACGTTGGATGAGCTGTGATGATCTTTCCCG35ACGTTGGATGTTCTTTGCCCCTGTGCAATG35CCCTGTGCAATGCTACTT36根据引物序列和样本量计算所需引物特定浓度的体积,提交给上海赛百胜基因技术有限公司进行引物合成。2563引物稀释及注意事项1引物稀释1稀释单管扩增引物至终浓度100M,加入去离子水混合后使得各引物浓度为05M。2稀释单管延伸引物至终浓度500M,加入引物混合后使得各引物浓度为8M、10M、15M。3按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数,进而根20安徽医科大学硕士学位论文据所需的浓度计算需加入去离子水的量。257基因分型2571PCR扩增反应1原理聚合酶链式反应POLYMERASECHAINREACTION,PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区域。每个PCR循环,反应混合体系都在模板变性、引物退火和引物延伸三种不同温度下依序温育。该过程可使用一种可编程序的温度热循环仪而达到自动化。2步骤1按照384板配置相关试剂。2已经标化至1525NG/L的样本,1,000G离心3分钟备用。3将各PCR组份溶解后置于冰上备用注意酶一定要保存在冰上,防止在高温中长时间暴露而失活。4扩增PCR反应组份。5将上述配好的试剂小心混匀后分在12孔的连排管中,每孔加入混匀试剂148UL。612道移液器吸取混合试剂4L加入到384孔板中,其中H11、H12、P11、P12孔留作对照,其孔中不加入引物,只含其他组份。7每板按照标记好的样本板加入相应的模板,加入体积为1L。8移液完成后,小心盖上384孔封板膜,并压牢每个孔,防止PCR程序时出现蒸发等现象。9扩增PCR反应程序949456727215MIN20SEC30SEC1MIN3MIN45CYCLES10配置1琼脂糖凝胶,每排留有25个孔,其中一个作为标记孔,其他加入PCR21安徽医科大学硕士学位论文反应后的产物。11进行电泳,吸取2L上样缓冲液,1LPCR产物,电压110V,电流75MA,40分钟后观察结果,如结果良好可继续SAP反应。2572SAP反应1按照384板配置相关试剂。2将配置好的溶液均匀分配到9