膳食诱导肥胖大鼠的肠道菌群结构的研究（可编辑）

膳食诱导肥胖大鼠的肠道菌群结构的研究上海交通大学硕士学位论文膳食诱导肥胖大鼠的肠道菌群结构研究姓名张翼申请学位级别硕士专业生物化学与分子生物学指导教师张晓君20090101上海交通大学理学硕士学位论文摘要膳食诱导肥胖大鼠的肠道菌群结构研究摘要近十几年以来,肥胖人群的数量增长速度惊人,肥胖及其导致的糖耐量异常、胰岛素抵抗甚至II型糖尿病等一系列代谢性综合症,已经严重影响到了人类的健康水平和生活质量。尽管许多研究表明,某些类型的肥胖可能和基因的突变有关,但是由于在短期内人类的基因型不可能发生重大的改变,所以目前肥胖研究者们已经将注意力集中到导致全球肥胖盛行的可能环境外因上。而作为人类后天获得的“第二基因组”,肠道微生物群落和宿主存在着互惠互利的共生关系已有研究表明,由于肠道菌群的存在能提高宿主从食物中摄取能量的效率、调控脂肪代谢以及引起低水平的慢性炎症反应,从而导致体重的增加和肥胖的发生。因此,探索肠道微生物与肥胖之间的关系日益成为国际学术界关注的焦点。本研究将同一批远交群SD雄性大鼠随机分成两组,第一组大鼠喂食高脂饲料HFD,为膳食诱导肥胖DIO组第二组大鼠喂食正常饲料,为对照组。从分组时的零时刻开始每周采集上述两组共13只大鼠的粪便样品,共持续7周。采用ERICPCR、群落杂交、实时定量PCR和变性梯度凝胶电泳DGGE等分子生态学技术结合主成分分析PCA、偏最小二乘分析PLS等多变量统计分析方法对造模前后样品的肠道菌群结构进行分析,试图揭示高脂饮食和正常饮食状态下菌群结构的变化和差异,并试图找到能够区分这种差异的关键因素和分子标记。本研究首先利用ERICPCR结合群落杂交对膳食诱导肥胖大鼠肠道菌第I页上海交通大学理学硕士学位论文摘要群的结构特征及分子标示物进行了研究。对两组大鼠粪便菌群总DNA进行ERICPCR和群落杂交揭示菌群结构的差异,结合多变量统计分析找出造成差异的关键条带,回收并对关键条带测序以鉴定该序列在系统发育上最接近的微生物物种,最后针对该片段的序列设计特异性引物进行荧光定量PCR对上述结果进行验证。结果发现高脂膳食组大鼠的肠道菌群结构与对照组有着显著的差异找到了一种仅仅出现在高脂膳食组的序列,这一特异序列可作为膳食诱导肥胖大鼠肠道菌群的分子标记物。本研究还对膳食诱导肥胖大鼠肠道菌群中的双歧杆菌类群进行了研究。通过双歧杆菌类群特异PCRDGGE技术阐明两组之间双歧杆菌类群种类的差异,利用荧光实时定量PCR技术对两组间双歧杆菌数量的差异进行比较,最后回收并对差异条带进行测序,确定其系统分类地位。结果发现两组之间的双歧杆菌类群组成结构上存在差异,鉴定出一条主要的差异条带与BIFIDOBACTERIUMMINIMUM存在着100的相似性,提示这种细菌可能与肥胖有一定的关系。通过上述研究,揭示了膳食诱导肥胖大鼠的肠道菌群结构与正常大鼠存在的差别,找到了一种肥胖大鼠的特异基因片段分析了双歧杆菌类群组成结构上的差异,鉴定出一种导致两组之间差异的双歧杆菌。这些结果对理解肥胖与宿主微生物肠道菌群之间的关系具有一定的参考价值。关键词肥胖、高脂膳食、肠道菌群、双歧杆菌、ERICPCR、DGGE第II页上海交通大学理学硕士学位论文ABSTRACTRESEARCHESONTHEGUTMICROBIOTASTRUCTUREOFDIETINDUCEDOBESITYRATSABSTRACTINRECENTDECADES,THEPOPULATIONWITHOBESITYHASINCREASEDINANASTONISHINGSPEEDOBESITYANDTHERELATEDDISORDERS,INCLUDINGTYPEIIDIABETES,HYPERTENSION,CARDIOVASCULARPATHOLOGYANDNONALCOHOLICFATTYLIVERDISEASE,HAZARDENORMOUSLYTHEHEALTHANDTHELIFEQUALITYOFTHEHUMANITYALTHOUGHTHEREAREALOTOFRESEARCHESWHICHDEMONSTRATETHERELATIONSHIPBETWEENOBESITYANDGENEMUTATION,SINCETHEGENOTYPEOFHUMANITYWOULDNOTCHANGESIGNIFICANTLYINARELATIVELYSHORTTIME,MANYRESEARCHERSHAVEDIVERTEDTHEIRATTENTIONTOTHEENVIRONMENTALFACTORSASTHESECONDGENOMEOFHUMAN,INTESTINALFLORAHASCOMMENSALRELATIONSHIPOFMUTUALLYBENEFITWITHTHEHOSTITHASBEENBROADLYRECOGNIZEDTHATTHEREEXISTSRELATIONSBETWEENOBESITYANDMICROBIALCONSTITUTIONWITHTHEIRIMPACTONMETABOLICANDPHYSIOLOGICALTUNEINTHEHOSTTHEREFORE,EXPLORATIONOFTHERELATIONSHIPBETWEENMICROFLORAANDOBESITYHASBECOMETHEFOCUSOFTHEACADEMIAINTHEWORLDINTHISRESEARCH,WEDIVIDEABATCHOFSDRATSRANDOMLYINTOTWOGROUPSTHEFIRSTGROUP,DIETINDUCEDOBESITYDIOGROUP,WASFEDWITHHIGHFATDIETHFD,WHILETHESECONDGROUP,CONTROLGROUP,WASFEDWITHNORMALCHOWDIETWESAMPLEDTHEIRFECESEVERYWEEKFROMTHESTARTPOINTTOTHESEVENTHWEEKSOMEMETHODSOFMOLECULARMICROBIALECOLOGY,ERICPCR,COMMUNITYHYBRIDIZATION,QUANTITATIVEPCRANDDENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESISDGGEETC,COMBINEDWITHMULTIVARIATESTATISTICALANALYSISPCA,PLSWEREAPPLIEDTOANALYZETHEMICROBIOTASTRUCTUREOFTHESAMPLESFROMBOTH第III页上海交通大学理学硕士学位论文ABSTRACTTIMEPOINTSWEATTEMPTTODEMONSTRATETHECHANGEANDDIFFERENCEOFINTESTINALMICROFLORABETWEENDIOGROUPANDCONTROLGROUPANDDISCOVERACRITICALFACTORANDMOLECULARMARKERWHICHCANDIFFERENTIATETHETWOGROUPSFIRST,WERESEARCHONTHEINTESTINALMICROBIOTASTRUCTUREOFDIETINDUCEDOBESITYRATSANDTHESPECIFICMOLECULARMARKERSERICPCRCOMBINEDWITHCOMMUNITYHYBRIDIZATIONWEREUSEDTOANALYZETHEDIFFERENCEOFFECALMICROBIOTASTRUCTUREBETWEENTHETWOGROUPS,WHILEMULTIVARIATESTATISTICALANALYSISWASUSEDTOIDENTIFYTHEMOSTIMPORTANTBANDSCAUSINGTHEDIFFERENCE,WHICHWERESEQUENCEDAFTERWARDSANDALIGNEDTOFINDTHESPECIESWITHTHECLOSESTRELATIONSHIPFINALLY,WEDEVISEDAPAIROFSPECIFICPRIMERSACCORDINGTOTHESEQUENCETOVALIDATETHERESULTSASARESULT,WEFINDTHATTHEREEXISTSSIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEENDIOANDCONTROLGROUPANDAMOLECULARMARKERWHICHEXISTEDONLYINDIOGROUPWASIDENTIFIED,WHICHCANBEUSEDASAMARKEROFTHEGUTMICROBIOTASTRUCTUREOFDIORATSSECOND,WECONDUCTEDRESEARCHESONINTESTINALBIFIDOBACTERIUMGROUPOFDIETINDUCEDOBESITYRATSBYGROUPSPECIFICPCRDGGEWEUSEBIFIDOBACTERIUMGROUPSPECIFICPCRDGGETODEMONSTRATETHEDIFFERENCEOFBIFIDOBACTERIUMSPECIESBETWEENTHETWOGROUPSANDREALTIMEQUANTITATIVEPCRTOCLARIFYTHEDIFFERENCEINQUANTITYTHECRITICALBANDSWEREALSOSEQUENCEDTOIDENTIFYITSSPECIESASARESULT,WEFINDTHATBIFIDOBACTERIUMSPECIESBETWEENTHETWOGROUPSISSIGNIFICANTLYDIFFERENTANDACRITICALBANDHASASIMILARITYOF100WITHBIFIDOBACTERIUMMINIMUM,WHICHISPROBABLYRELATIVETOOBESITYTHROUGHTHERESEARCHESABOVE,WEDEMONSTRATETHEDIFFERENCEOFINTESTINALMICROBIOTASTRUCTUREBETWEENDIOANDNORMALRATSANDFOUNDASPECIFICGENEFRAGMENTOFDIORATSTHEN,WEANALYZETHESTRUCTURALDIFFERENCEOFBIFIDOBACTERIUMGROUPBETWEENDIOANDNORMALRATSANDIDENTIFIEDASPECIESOFBIFIDOBACTERIUMWHICHISSPECIFICALLYFOUNDINDIOGROUPTHESE第IV页上海交通大学理学硕士学位论文ABSTRACTRESULTSCANHELPUSFURTHERUNDERSTANDTHERELATIONSHIPBETWEENOBESITYANDINTESTINALMICROBIOTASTRUCTUREOFTHEHOSTKEYWORDSOBESITY,HIGHFATDIET,INTESTINALMICROFLORA,BIFIDOBACTERIUM,ERICPCR,DGGE第V页上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名张翼日期2009年2月2日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密,在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。请在以上方框内打“”学位论文作者签名张翼指导教师签名张晓君日期2009年2月2日日期2009年2月2日上海交通大学理学硕士学位论文第一章肠道微生物与肥胖关系的研究进展第一章肠道微生物与肥胖关系的研究进展11人体肠道微生物生态学进展111人体肠道微生物概述14人体肠道内至少定植有5001000种不同的细菌1,其细胞数量10是人体13细胞数量10的10倍左右2,健康人体肠道内含有的细菌重量约为1KG。数量如此之巨的细菌所携带的基因数是人体自身基因的100倍3。在人粪便样品中,细菌11细胞占到体积的30,干粪便重量的1/3都是由细菌组成,每克粪便样品中含有10个细胞46。正因为人体内菌群的重要性,LEDERBERG提出微生物组MICROBIOME这一概念来描述人体内部微生物的基因组,他认为对现代智人HOMOSAPIENS的完整的遗传描述应该包括人类自身的基因组和人体微生物基因组7BACKHED认为肠道菌群可以视为人体的一个代谢器官,因为它具有某些人类所不具备的生理功能82004年NICHOLSON提出人是由人体真核细胞和体内共生的微生物群落所共同构成的“超级生物体SUPERORGANISM”这一概念,认为人体及其菌群之间存在着复杂的相互影响相互作用的过程,因此对人体生理及病理过程的各种研究中必须考虑到微生物群落的影响9。SIMPSON等人利用DGGE技术研究猪肠道菌群结构发现,除盲肠外,每一段胃肠道中的内容物菌群结构与该段的粘膜粘附菌的菌群结构基本一致,相比之下,消化道不同区段如胃、小肠近端、小肠远端、盲肠、结肠近端、结肠远端以及直肠的细菌组成明显不同,其中大肠是肠道微生物定植最密集的部位10。分段介绍如下1胃胃内PH值很低,含大量消化酶,不适合大部分细菌的生长,因此细菌数量很少,主要是一些需氧抗酸性细菌,如链球菌STREPOCOCCI、乳酸杆菌LACTOBACILLI、表皮葡萄球菌STAPHYOCOCCUSEPIDERMIDIS和白色念珠菌MONILIAALBICAN等11,12,这些细菌中有一些是来源于口腔或食物中未被消化的过路菌132小肠小肠上端虽然PH稍偏碱性,但由于分泌有胆汁、胰液等消化液且第1页上海交通大学理学硕士学位论文第一章肠道微生物与肥胖关系的研究进展肠道内含有各种消化酶,加之小肠上段的蠕动剧烈,肠液流量大,而肠液中的黏液是构成肠道化学屏障的基础成分,它是由肠上皮杯状细胞分泌的大分子糖蛋白,与碳酸氢盐、免疫球蛋白、表面活性磷脂和小肠三叶肽等构成一层黏附于肠道上皮表面的凝胶层,导致微生物在此处无法稳定定植,所以小肠上段菌群的数量同样很低,主要是一些链球菌和乳酸杆菌但是小肠下段含有大量的微生物菌群3空肠空肠一般只有少量细菌,正常人空腹时空肠中的细菌类群以少量革兰氏阴性好氧菌为主,如链球菌、葡萄球菌STAPHYOCOCCUS等,还包括一些兼性厌氧菌如乳杆菌和肠球菌ENTEROCOCCUS以及少量酵母和作为过路菌的大肠杆菌ESCHERICHIACOLI等,而厌氧类杆菌则阙如4回肠回肠中细菌数量有所增加,上段回肠与空肠相似,下端回肠平均细菌数量增多,微生物区系与结肠类似,以厌氧菌为主,含有大量拟杆菌BACTEROIDES、大肠杆菌和双歧杆菌BIFIDOBACTERIUM等,这些细菌或由结肠从盲瓣反流而来,在回盲瓣以前以革兰氏阳性菌占优,之后以革兰氏阴性菌占优5盲肠和结肠结肠是大肠中盲肠、结肠和直肠最长的一段,被分为右结肠结肠近端、横向结肠和左结肠结肠远端,相比小肠而言它的运动力低下,从而有利于微生物的繁殖,是肠道中细菌数量最多的区域。在盲肠和右结肠,多糖发酵过程很剧烈,产生很多的短链脂肪酸丙酸、丁酸等,PH介于56之间,细菌的生长也相当迅速而在左结肠和结肠末端,发酵所需多糖底物已被大量消耗,PH环境接近中性,细菌生长速度减慢,形成了一个动态、复杂、含菌量非常高的微生物体系9。其中厌氧菌占绝对优势98,主要真细菌类群包括革兰氏阴性厌氧杆菌、梭杆菌FUSOBACTERIUM乳杆菌、革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌以及多种厌氧肠球菌。兼性厌氧菌如大肠杆菌、变形杆菌PROTEUS、克雷伯氏菌KLEBSIELLA等只占很小的比例。HAYASHI等人利用末端限制性片段长度多态性TERMINALRESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,TRFLP和克隆文库技术比较了3例老年人空肠、回肠、盲肠、直肠、乙状结肠内容物的菌群结构,结果发现空肠和回肠中的菌群组成比较简单,主要类群包括链球菌STREPTOCOCCI,乳酸杆菌LACTOBACILLI,变形杆菌GAMMAPROTEOBACTERIA、肠球菌ENTEROCOCCUS和拟杆菌BACTEROIDES等盲肠内的菌群组成多样性要高于空肠和回肠,主要类群包括球形梭菌CLOSTRIDIUMCOCCOIDES,柔嫩梭菌CLOSTRIDIUMLEPTUM和拟杆菌BACTEROIDES等直肠和乙状结肠内的菌群组成也很复杂,包括大量的球形梭菌CLOSTRIDIUMCOCCOIDES,柔嫩梭菌CLOSTRIDIUMLEPTUM,拟杆菌BACTEROIDES,变形杆菌GAMMAPROTEOBACTERIA,第2页上海交通大学理学硕士学位论文第一章肠道微生物与肥胖关系的研究进展双歧杆菌BIFIDOBACTERIUM,乳酸杆菌LACTOBACILLI和链球菌STREPTOCOCCI等14。112人体肠道内的重要微生物肠道中的细菌按照作用可分为三个部分1生理性细菌是定植于肠道的优势菌群,均为专性厌氧菌,如双歧杆菌、拟杆菌、真杆菌EUBACTERIUM和消化球菌PEPTOCOCCUS等,具有营养及免疫调节作用2条件致病菌肠道非优势菌群,以兼性需氧菌为主,如肠球菌ENTEROCOCCUS、肠杆菌ENTEROBACTER、克雷伯氏菌KLEBSIELLA、不动杆菌ACINETOBACTER等,在肠道微生态平衡时对宿主是无害的,一旦这种平衡被打破,则具有侵袭性和致病性,例如肺炎克雷伯氏菌KPENEUMONIAE可引起新生儿支气管炎、肺炎老年人、早产儿和新生儿以及手术创伤可能会导致不动杆菌感染3病原菌多为过路菌,肠道生态平衡时,肠道内正常菌群的作用使这些菌定植的机会减少,不会致病如果数量超出正常水平,则会引起宿主疾病,如变形杆菌PROLEUS引起食物中毒、假单胞菌PSEUDOMONAS和产气荚膜梭菌CLOSTRIDIUMPERFRINGENS等。按类群来分,人体肠道中的细菌大多属厌氧菌,已鉴定的种类来自于8个门15拟杆菌门BACTEROIDETES、厚壁菌门FIRMICUTES、变形菌门PROTEOBACTERIA及其余5个稀有类群,这个数字要远远小于环境样品但是肠道菌群种类虽然较少但其菌株却表现出高多样性16。在上述8个门中,最优势的两个门分别是厚壁菌门和拟杆菌门6,总数达到98以上而在厚壁菌门中有95属于梭菌纲CLOSTRIDIA17。SUAU通过16SRRNA基因克隆文库技术对人粪便样品进行分型测序后发现,95的克隆来自拟杆菌普雷沃氏菌BACTEROIDESPREVOTELLA类群、球形梭菌CLOSTRIDIUMCOCCOIDES类群和柔嫩梭菌类群CLOSTRIDIUMLEPTUM18。从种的水平上来看,研究发现人粪便样品中占所有细菌细胞数99左右的最优势细菌只有3040种19。2000年SGHIR等人利用寡核苷酸探针杂交技术对人粪样品中的菌群结构进行了分析,结果表明人体肠道内存在以下一些主要微生物类群以拟杆菌普雷沃氏菌卟啉单胞菌类群BACTEROIDESPREVOTELLAPORPHYRPMONAS为最多,占粪便菌群的3716,球形梭菌CLOSTRIDIUMCOCCOIDES和柔嫩梭菌CLOSTRIDIUMLEPTUM其次,各占167和146,而双歧杆菌BIFIDOBACTERIUM,肠杆菌ENTEROBACTER,乳杆菌链球菌肠球菌类群LACTOBACILLUSPEPTOSTREPTOCOCCUSENTEROCOCCUS各只占肠道菌群的1左右20。以上各主要类群的微生物的特点及作用将在112中详述。需要说明的是肠道菌群特别是肠道粘膜粘附菌的组成与粪便样品中微生物的组成有着较大的第3页上海交通大学理学硕士学位论文第一章肠道微生物与肥胖关系的研究进展差异21然而,由于人体粘膜菌取样的不便以及粪便样品可以在某种程度上反映肠道菌群的组成等原因,目前大部分对于人体肠道微生物的研究,多数还是以粪便样品为研究材料的。1121拟杆菌BACTERIODES拟杆菌BACTERIODES,又称类杆菌,是一种不形成孢子、有胆汁抗性的厌氧革兰氏阴性杆菌,是人体肠道内菌群数量最大的微生物类群之一,主要定植于口腔、上10呼吸道和肠道中。1G健康人的粪便中拟杆菌的数量可达3210个,在肠道中大约占细菌细胞总数的25以上2224,能分解碳水化合物,形成乙酸和琥珀酸。其分类地位是拟杆菌门BACTEROIDETES拟杆菌纲BACTEROIDETES。早先对拟杆菌的定义不严格,许多革兰氏阴性厌氧菌都被划入这一种群中。现在狭义的拟杆菌定义仅包括以脆弱拟杆菌BACTEROIDESFRAGILIS为模式种的不产色素的种群而原先划分在拟杆菌中的产黑色素、代谢产生丁酸和乙酸的口腔拟杆菌群的菌株被归入普雷沃氏菌属PREVOTELLA,这是与龋齿的菌斑有关的一个类群DNA的GC含量为4548MOL、能产生卟啉色素、发酵含氮化合物而不发酵碳水化合物的种类被归入卟啉单胞菌属PORPHYRPMONAS,这是动物粘膜系统的一种正常菌群,但也可能引起机会感染以上三者共同组成拟杆菌普雷沃氏菌卟啉单胞菌类群BACTEROIDESPREVOTELLAPORPHYRPMONAS。从人的粪便样品中能够分离得到的最常见的拟杆菌包括普通拟杆菌BACTEROIDESVULGATUS、多形拟杆菌BTHETAIOTAMICRON、吉氏拟杆菌BDISTASONIS、艾格茨氏拟杆菌BEGGERTHII和脆弱拟杆菌BFRAGILIS等25。其中有些拟杆菌如脆弱拟杆菌BACTEROIDESFRAGILIS是机会致病菌,在某些条件下会引起宿主疾病,如下腹肿痛,伤口感染、菌血症等,其致病力较强且对许多常用的抗生素耐药。此外拟杆菌对静脉管壁有亲和力,容易形成血栓导致组织坏死26,27。拟杆菌的最主要功能在于吸收和降解多糖,包括许多人体自身难以利用的植物多糖28。以目前研究最为透彻的模式菌多形拟杆菌BACTEROIDESTHETAIOTAOMICRON,ATCC29148为例,其基因组全长626MB,编码4776个蛋白,其中数量最多的是编码多糖降解转运相关酶类、细胞表面多糖连接相关蛋白、荚膜多糖合成蛋白、环境感应和信号传导蛋白以及DNA移位相关蛋白转移酶等基因29。研究发现这种拟杆菌具有SUSC和SUSD这两种与淀粉和低聚麦芽糖的结合与输入有关的外膜蛋白的旁系同源物达209个,人们还从它的基因组中找到226个糖苷水解酶和15种可能的多糖第4页上海交通大学理学硕士学位论文第一章肠道微生物与肥胖关系的研究进展裂解酶的编码基因28,30,是所有已测序的细菌中最多的。其中包括半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖醛酸糖苷酶、呋喃果糖苷酶、甘露糖苷酶、淀粉酶以及1,2木糖苷酶等。这样庞大的多糖代谢相关基因的存在,使得它可以利用多种植物多糖甚至是宿主的粘膜和组织多糖,如硫酸软骨素、粘蛋白、透明质酸盐和肝磷脂等29。与此相比,人类基因组中具有消化吸收多糖的基因数量仅相当于多型拟杆菌的1/6428,且缺乏能分解木糖、果胶和阿拉伯糖等膳食中常见的多糖的酶。还有报道发现拟杆菌能诱导宿主单糖转运31。GORDON研究小组将多形拟杆菌BTHETAIOTAMICRON接种至无菌小鼠体内,结果表明这种肠道共生菌可以调节包括营养吸收、黏膜防御、外源物质代谢、血管形成以及出生后肠道成熟等多种肠道重要基因表达31。此外,拟杆菌还具有下列功能加快肠粘膜的血管形成32、促进免疫系统发育增强宿主免疫力33、维持肠道微生态平衡等31,34。1122乳酸菌LACTICACIDBACTERIA乳酸菌LACTICACIDBACTERIA,LAB不是系统分类上的一个分类单位,而是指一类可发酵糖类产生大量乳酸的无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称,包括乳杆菌属LACTOBACILLUS、片球菌属PEDIOCOCCUS分类地位同属厚壁菌门芽孢杆菌纲BACILLI乳杆菌科LACTOBACILLACEAE、链球菌属STREPTOCOCCUS、乳球菌属LACTOCOCCUS门纲同上,同属链球菌科STREPTOCOCCACEAE、魏斯氏菌属WEISSELLA门纲同上,属明串珠菌科LEUCONOSTOCACEAE等18个属共200多种细菌,在自然界和人及动物肠道系统中广泛存在,有些是人和动物的条件致病菌或致病菌,有些是人体口腔和肠道中的正常菌群多数为同型发酵发酵葡萄糖产生85或更多的乳酸,少数为异型发酵产生等摩尔比例的乳酸CO、乙醇/乙酸,如肠膜状明串珠菌LEUCONOSTOC2MESENTEROIDES是制药工业上生产右旋糖酐代血浆的重要菌种。乳酸菌不产生腐败产物,不形成内生孢子,无运动性或极少运动,是科学家已发现的主要益生菌,担负着人体多种重要的生理功能,与机体健康息息相关35。在健康成人肠道内普遍存在,而随着人的年龄增长或健康状况的下降会逐渐减少36。乳链球菌STREPTOCOCCUSLACTIS、嗜热链球菌STHERMEPHILUS、德氏乳酸杆菌LACTOBACILLUSDELBRUECKII和保加利亚乳杆菌LBULGARICUS等多种乳酸菌被广泛应用于酸奶、乳酪、泡菜等发酵食品生产和医药、畜牧等行业中37。酸奶的制作就是利用乳酸菌保加利亚乳杆菌嗜热链球菌32将牛奶中的乳糖发酵为乳酸,同时产生乙醛、丁二酮、3羟2丁酮、丙酮和双乙酰等风味物质。第5页上海交通大学理学硕士学位论文第一章肠道微生物与肥胖关系的研究进展2001年WALTER等人用乳酸菌特异性引物结合PCRDGGE的分析方法,专一性地对人粪样品中的乳酸菌组成进行了分析。结果发现,人粪便样品中乳酸菌的组成图谱具有个体特异性38。ZOETENDAL等人也用类似的方法对肠道粘膜样品和粪便样品中乳酸菌的组成情况进行了分析比较,发现粘膜和粪便样品中乳酸菌的组成类似,且同样具有个体特异性21。肠道中乳酸菌有如下一些重要的作用1可抑制有害菌的繁殖。乳酸菌能产生乳酸和过氧化氢HO以及细菌素LACTACIN等抗菌物质,因此乳酸菌对难辨梭22菌CLOSTRIDIUMDIFFICILE、空肠弯曲菌CAMPYLOBACTERJEJUNI、幽门螺杆菌HELICOBACTERPYLORI与轮状病毒ROTAVIRUS等致病微生物的侵袭具有一定的抵抗作用,因此乳酸菌类益生素对胃肠道的感染具有一定的预防与治疗作用39,402乳酸菌的代谢产生的有机酸能降低肠道内的PH值,从而抑制硝酸盐还原菌的生长和繁殖,减少致癌物质亚硝胺的形成也能够抑制产气荚膜杆菌等腐败菌,减少粪臭素、吲哚、硫化氢等有害物质的产生3能激活机体的免疫系统,特别是巨噬细胞、自然杀伤细胞NATURALKILLERCELL,NK细胞和B淋巴细胞。除此之外,乳酸菌还具有降低血清胆固醇、结合致突变物质如黄曲霉素从而抗突变、抗高血压、抑制过敏症状、抑制细菌移位和预防龋齿等作用4144。1123梭状芽孢杆菌CLOSTRIDIUM梭状芽孢杆菌CLOSTRIDIUM,又称厌氧芽孢杆菌,简称梭菌,是细菌中种类最多的一个属。菌体呈梭状,是一类能产生内生孢子的兼性厌氧孢子生成过程严格厌氧革兰氏阳性杆菌。其产生芽孢圆形或椭圆形,常比菌体大,因此常常呈鼓槌的形状。除产气荚膜梭菌CLOSTRIDIUMPERFRINGENS外,大多有鞭毛。系统分类属厚壁菌门FIRMICUTES梭菌纲CLOSTRIDIA。梭菌属广泛分布于自然界,以土壤中为最多。大部份的梭菌可以水解糖、蛋白质等有机物,水解为酸、醇、二氧化碳氢气和其他无机物,又可产生外毒素。在梭菌属中有许多重要的病原菌,如寄生在人的肠道内的难辨棱状芽孢杆菌又称艰难梭菌CLOSTRIDIUMDIFFICILE,属厌氧性细菌,能引起婴幼儿的胃肠道感染与过敏症的发生45产气荚膜梭菌CPERFRINGENS是气性坏疽的主要病原菌,可引起伤口气性坏疽、食物中毒、肌肉坏死、梭菌蜂窝织炎等病症破伤风梭菌CTETANI可引起破伤风肉毒梭菌CBOTULINUM在厌氧条件下引起食物腐败,可引起肉毒中毒。梭状芽孢杆菌中,以球形梭菌CCOCCOIDES,CLUSTERXIVA与柔嫩梭菌CLEPTUM,第6页上海交通大学理学硕士学位论文第一章肠道微生物与肥胖关系的研究进展CLUSTERIV为数量最大的2个类群,柔嫩梭菌在肠道细菌中所占的比例约为167球形梭菌的比例约为14620。这两个类群中的某些种如丁酸梭菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUM又名丁酸菌或酪酸菌能发酵产生丁酸,而丁酸是肠上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质,可抑制肠道内的病原菌或腐败菌的生长,促进益生菌如双歧杆菌、乳酸菌等的发育和增殖46此外梭菌还具有淀粉糖化作用,在肠道内能产生多种维生素和酶类,对结肠上皮细胞的能量代谢与发育起到了重要的作用。张美玲等用梭菌类群特异DGGE研究了24个个体肠道粘膜菌的组成。溃疡性结肠炎患者的溃疡黏膜与非溃疡黏膜黏附细菌中,柔嫩梭菌组成存在明显差异,提示该类群可能与溃疡性结肠炎的发生有一定的相关性47。徐灵筠等用类群特异PCRDGGE等方法对照组、静脉注射链脲佐菌素STZ抵抗组、STZ易感组的三组小鼠粪便菌群结构进行分析,发现三组小鼠的梭菌群落结构表现出较明显的个体差异,而且小鼠肠道中占优势的梭菌数目很可能超过26种,多样性较高。今年SCANLAN等研究者利用DGGE技术比较了结肠癌患者与健康个体的肠道菌群结构,发现结肠癌患者中球形梭菌CCOCCOIDES与柔嫩梭菌CLEPTUM的多样性均明显高于健康个体48。1124双歧杆菌BIFIDOBACTERIUM双歧杆菌BIFIDOBACTERIUM是HENRYTISSIER于1899年在法国巴斯德实验室从母乳营养儿的粪便中分离出来的存在于人体肠道内的一种重要的益生菌,属厌氧耐氧能力随种属而不同、不运动、不形成孢子、GC含量高的革兰氏阳性菌。细胞呈多形态,如Y形、V形、L形、多分枝形、短杆形、棒状形固体培养基上菌落为圆形、隆起呈透镜状、色微白、不透明、表面光滑柔软、不形成菌丝体。化能有机营养,发酵碳水化合物活跃,产物主要为乙酸和乳酸,不产二氧化碳、丁酸和丙酸。主要分离于温血脊椎动物肠道、昆虫和垃圾。分类地位属放线菌门ACTINOBACTERIA放线菌纲ACTINOBACTERIA。现已发现的双歧杆菌有30多个种,其中来自人体的有12种49。MATSUKI等人对多种双歧杆菌设计特异性引物进行PCR,对48个成人与27个婴儿肠道中双歧杆菌组成进行了研究,结果发现约92的成人粪便样品中都含有双歧杆菌50。人体肠道内的双歧杆菌组成具有个体差异性,且在一定时间内保持稳定。其中青春双歧杆菌BIFIDOBACTERIUMADOLESCENTIS是人粪便样品中最为常见的一类双歧杆菌51。双歧杆菌的构成随着年龄的变化而不断改变。人的一生中,婴儿期肠道内双歧杆菌的数量第7页上海交通大学理学硕士学位论文第一章肠道微生物与肥胖关系的研究进展最高,婴儿出生8个月到16个月之间肠道中最多的是分叉双歧杆菌BBIFIDUM与长双歧杆菌BLONGUM52。成人肠道中最常见的双歧杆菌包括下列数种假小链双歧杆菌BPSEUDOCATENULATUM、链状双歧杆菌BCATENULATUM、长双歧杆菌BLONGUM和青春双歧杆菌BADOLESCENTIS50,53,54。随着年龄的增长,双歧杆菌的数量逐渐下降,老年人肠道内的双歧杆菌数量很低55。双歧杆菌对人体的生理状况具有重要的影响,主要有下列作用1产生的菌体外多糖EXOPOLYSACCHARIDE,EPS可以增强对肠粘膜的吸附作用56,通过粘附于肠上皮细胞表面可以防止病原菌或条件致病菌的定植5758此外多种双歧杆菌均能产生广谱抗菌物质BIFIDIN,它能抑制李斯特菌LISTERIA、沙门氏菌SALMONELLA、志贺氏菌SHIGELLA和霍乱弧菌VIBRIOCHOLERAE的生长59双歧杆菌还能产生胞外糖苷酶,可降解作为致病菌和细菌毒素的肠粘膜上皮细胞多糖2发酵产生有机酸如乳酸和醋酸等,不仅可使肠道PH值下降从而抑制腐败菌的生长,使得吲哚、亚硝酸胺等致癌物质减少,抑制癌症的发生而且能提高钙、磷、铁等元素的利用率,促进铁和维生素D的吸收3可以合成有多种维生素,如维生素B1、B2、B6、B12、泛酸、叶酸和生物素以及丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和苏氨酸等人体必需的氨基酸60,614双歧杆菌可以促进肠道蠕动,改善便秘,及时排出对人体有害的物质625作为免疫原可诱导增强机体的各种免疫功能,使淋巴细胞增殖,增强NK细胞的活性,使抗体产生细胞活化,各种细胞因子增多,从而增强机体免疫功能63,646双歧杆菌可使胆固醇转化为人体无法吸收的粪甾醇,随着粪便排出体外,因而可以起到降血酯作用7双歧杆菌还能发酵产生半乳糖,是神经系统中重要分子脑苷脂的成分,能促进婴儿的脑部发育等。1125肠杆菌ENTEROBACTERIACEAE肠杆菌科ENTEROBACTERIACEAE属变形菌门PROTEOBACTERIA变形菌纲GAMMAPROTEOBACTERIA,是革兰氏阴性无芽孢直杆菌,化能有机营养,兼营呼吸代谢和发酵代谢,可通过氧化多种简单有机化合物或发酵糖、有机酸或多元醇获取能量。广泛分布于土壤、水体和人体肠道中。大多数肠杆菌是正常菌群或机会致病菌,少数为致病菌65。肠杆菌科内有一些在宿主肠道内发挥重要作用或致病的细菌,择其重要者介绍如下1埃希氏菌属ESCHERICHIA。包括目前研究最透彻的模式微生物大肠杆菌ESCHERICHIACOLI,它生活在任何温血动物的肠道中,占大肠全部细菌的1,婴儿第8页上海交通大学理学硕士学位论文第一章肠道微生物与肥胖关系的研究进展出生后数小时大肠杆菌就会通过口腔定植于肠道中,作为肠道中的正常菌群发挥生理作用。它能抑制肠道内腐败微生物的繁殖和生长,合成维生素B和K,以及有杀菌作用的大肠杆菌素COLICIN。不过某些血清型的大肠杆菌可引起感