重组人白细胞介素11对实验性银屑病动物模型的影响

重组人白细胞介素11对实验性银屑病动物模型的影响山东大学硕士学位论文重组人白细胞介素11对实验性银屑病动物模型的影响姓名王进申请学位级别硕士专业药理学指导教师李应全张岫美20040426原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。日期论文作者签名兰望巡垒尘塑目关于学位论文使用授权的声明本人完全了解【LL东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定期论文作者签名二盟导师签名批日山东人学硕I一学位论史中文摘要重组人白细胞介素11对实验性银屑病动物模型的影响硕士研究生王进导师李应全副教授张岫美教授银屑病是一种常见的自身免疫性炎性和增殖性皮肤病。其发病率较高，治愈率低且易复发。本病基本为种世界病，终身病，严重影响了病人的生活质量和健康水平。其病因除与感染、应激、遗传等因子相关外，现在认为免疫调节机能失衡是引起病理损伤的主要机制。目前国内外用于治疗本病的药物主要靠肾上腺皮质类固醇激素类、抗代谢药、环孢素A、中药等，虽均有效，但多为只对症，难以治愈。免疫疗法对该病的治疗基本未开发，处于启动阶段。因此寻找一些具有抑制或对抗银屑病促发细胞因子、纠正失衡的免疫调节功能、抑制角质过度增生和分化障碍、减轻炎症反应，从而从源头上对本症进行治疗的生物制剂至关重用于治疗恶性肿瘤放、化疗后发生的皿小板减少症。近期BRUCEE等人报道了SRHLLL对CROHNS病具有保护作用，BQIU等报道RHIL11对结肠炎也有保护作用，WILLAML报道用本品治疗牛皮癣具有一定的疗效，研究显示RHIL11具有免疫调节功能，可以减少炎性细胞因子的表达，减轻角质细胞增生。所以，RHLLLL对于在病因、病理许多方面与上述疾病基本相同的银屑病应具有较好的防治作用。雌激素周期小鼠阴道上皮细胞分裂和鼠尾鳞片表皮颗粒层形成是银屑病的动物实验模型，它们分别模拟了银屑病基本病理生理的两个方面表皮增牛过快和角朊细胞分化不良角化不全。DNFB二硝基氟苯致小鼠耳部皮肤接触性过敏性皮炎模拟了银屑病病变中的非特异性、慢性炎症。本研究通过观察RHIL一1L对实验性银屑病病理模型的影响，将分别观察RHLL一11对银屑病模型小鼠尾颗粒细胞生成和阴道上皮细胞增殖的影响，及对2，4一硝基氟苯DNFB致小鼠耳部皮肤接触性过敏性皮炎瘸变的影响，同时分别测定药前、后动物血清中IL一2的含量，并用免疫组化方法测定病变组织中ICAM一1的含量，用放射免疫分山东大学颈士学位论文析法测定血清中IL一6和TNFA的水平。可反映出重组人白细胞介索一1L对银屑病促发因子含量的影响继而从细胞因子水平进一步探讨其对银屑病的作用。揭示其对银屑病的可能治疗机制。通过三种动物模型的试验，结果显示，RHIL1L抑制表皮细胞分裂增殖和促进皮肤颗粒层细胞生成作用，减轻炎症反应，及抑制血清、皮肤中多种致炎性细胞因子与致角质细胞增殖因子的作用。为临床开辟利用基因工程生产的细胞因子治疗银屑病的免疫疗法和开发RHIL一11的新用途提供了理论依据。关键词重组人白细胞介素一1LRHIL11，银屑病，细胞因子，角化不全，有丝分裂山东人半顺L学位论文ABSTRACTEFFECTTSOFRECOMBINANTHUMANINTERLEUKIN11ONEXPERIMENTALPSORIASISMODELSGRADUATEJINWANGDIRECTORLIXIUMEIYINGQUANZHANGITISWELLKNOWNCANDOTHATPSORIASISHARMTOHUMANSHEALTHGREATISMECHANISMTHEMOSTOFTHEDISEASE，SOMEJMMUNOLOREGULATIONIMPORTANTCYTOKINESANOFROLEINTHECOURSERESEARCHESHAVEBEENIMPORTANTPLAYSDISEASETHOUGHMANYDONEINTHEMECHANISMSOFFARFOREFFECTIVETHEPSORIASIS，SOINVESTIGATINGDRUGSTREATMENTOFPSORIASISLIMITEDAREQUITEWEHAVESTUDIEDEFFECTSOFTHERECOMBINANTHUMANINTERLEUKIN一11THERAPEUTIC1PSORIASISANIMALMODELSTHE1ONMITOSISRHILEXPERIMENTALVAGINALEPITHELIUMOFESTRONEMICEANDTHEFORMATIONOFWEREMOUSETAILSCALEUSEDPERIODICALEPIDERMISMODELANDTHEASTHEEPIDERMISMODEL，HYPERPLASIAEPIDERMISPARAKERATOSISTOUSEDINDUCEANDCONTACTPSORIASISMODELINOFEXPERIMENTALSENSITIVITYMICEEXPRESSIONADHESIONINTERCELLULARDETECTEDMOLECULE一1ICAM一1WASBYSTUDIESANDIMMUNOSORBENTINTERLEUKIN2IL2WASENZYMELINKEDINVESTIGATEDBYASSAYLEVELOFTISSUENECROSISELISASERUMINTERLEUKIN一6IL一6ANDMEASUREDWITHRADIOIMMUNOASSAY1OURRESULTSDEMONSTRATEDTHATRHIL一1INHIBITTHEMITOSISOFMOUSESIGNIFICANTLYTHETHEFORMATIONOFMOUSETAILSCALEANDPROMOTEDEPIDERMIS，VAGINALEPITHELIUMTHERHLLIICANALSOINHIBITPSORIASISMODELOFSIGNIFICANTLYEXPERIMENTALTODNFBINDUCEDCONTACTMECHANISMSOFRHIL一11BERELATEDMAYSENSITIVITYTHETHEIEVELSOFII。一2、ICAM一1ANDTNFAETCDECREASE山东人学硕|二学位论文INANIMALRHLL11HASMODELTHETREATINGGOODEFFICACYPSORIASISBYINBITINGAND1RHLL一1INFLAMMATORYMAYEPIDERMISHYPERPLASIA、PAMKERATOSISREACTION，SUGGESTINGHAVEVALUMEINTHEANDTREATMENTOFINTHEFUTURETHEMOREPOTENTIALPREVENTIONPSORIASISMECHANISMSOFRHLL11ALENEEDFURTHERTREATINGPSORIASISSTUDYKEYHUMANWORDSRECOMBINANTMITOSIS4山东大学硕J学位论文符号说明英文全名英文缩写中文RHLL11RECOMBINANTHUMANINTERLEUKIN11重组人白细胞介素1LICAM1INTERCELLULARADHESIONMOLECULE细胞间粘附分子1CELLNUCLEAR增殖细胞核抗原PCNAPROLIFERATINGANTIGENIL2INTERLEUKIN2白细胞介素一2DNFBDINITROFLUOROBENZENE二硝基氟苯MTXMETHOTREXATE甲氨喋呤IFNYINTERFERONY干扰素一YIL一1INTERLEUKIN1白细胞介素一1IL一4INTERLEUKIN4白细胞介素一4IL一6INTERLEUKIN一6白细胞介素一6IL一8INTERLEUKIN8白细胞介素一8IL一10INTERLEUKIN10白细胞介素一LOTNF呱TUMORNECROSISFACTORA肿瘤坏死因子一AIMMUNOADSORDENTELISAENZYMELINKEDASSAY酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附试验ANDEOSIN苏木精和伊红HEHEMATOXYLINBUFFEREDSALINE磷酸盐缓冲液PBSPHOSPHATEODDENSITY吸光度OPTICALSCSUBCUTANEOUS皮下注射INJECTIONADHESIONMOLECULE一1ELAMLENDOTHELIALLEUKOCYTE内皮细胞白细胞粘附分子一1VCAM一1CELLVASCULARADHESIONMOLECULE1血管细胞粘附分子1NOMONOXIDE一氧化氮NITROGENRIARADIOIMMUNOASSAY放射免疫分析法SABCSTREPTOAVIDINBIOTINCOMPLEX链霉亲合素一生物素复合物REVOLUTIONSMINUTE转，分钟RPMPER天DDAYHHOUR小时MINMINUTE分钟山东大学硕士学位论文重组人白细胞介素一11对实验性银屑病动物模型的影响王进硕士研究生导师李应全副教授张岫美教授前言近20年来，借助于分子生物学技术的应用，细胞因子研究取得了惊人的进展【L】，表现在1数十种细胞因子及其受体的基因被相继克隆和重组，推动了其结构与功能关系的研究，揭示了细胞因子活性交叉的物质基础；2转基因和基因敲除技术运用到细胞因子网络研究；3发现细胞因子可产生和作用于中枢神经系统，促进了神经内分泌免疫学的诞生4细胞因子基因调控和信号传导系统研究取得了突破；5重组细胞因子成为最具活力的新兴的生物制药产业；6细胞因子检测技术日臻成熟，从单一的生物活性测定法，发展到免疫化学测定法和逆转录一聚合酶链反应法RTPCR等。细胞因子既是免疫系统的信息传递介质，又是神经、内分泌及其他系统和免疫系统相互联系的重要桥梁。此外，细胞因子还沟通免疫系统和其他非免疫系统的联系，因而研究细胞因子具有广泛的生物学和临床意义。银屑病为一种常见的与遗传密切相关的自身免疫性炎性和增殖性皮肤病。人群发病率约20，治愈率低且极易复发。本病基本上为一种世界病、终身病，其病因除与遗传、感染、应激等因子相关外，免疫调节机能失衡是引起病理损伤的主要机制脚【31。在本病发病过程中，R细胞功能低下，T。细胞和B细胞功能亢进，炎症及皮肤损害。近年研究表明，在TH细胞中，又分为THL和TH2两种细胞，THI细胞主要介导细胞免疫和炎症反应，可分泌IL一2、IFNY等促炎因子诱发或加剧本病，同时抑制TH2细胞扩增和释放IL一4、IL一10等抗炎因子。而TH2细胞主要参与B细胞增殖，可分泌IL一4、IL一10等抗炎因子而抑制THL细胞扩增及释放促炎因子I。山东火学碗一L学位论文本研究将分别观察重组人白细胞介素一11对三种动物模型一雌激素周期小鼠阴道上皮细胞和鼠尾鳞片表皮病变【5J和2，4二硝基氟苯DNFB致小鼠耳部皮肤接触性过敏性皮炎试验的效果，同时分别测定药前、后动物血清中相关促发因子的水平变化。可反映出重组人白细胞介素一LL对银屑病促发因子生成含量的影响，从而揭示其对银屑病的可能治疗机制。目前国内外用于治疗本病的药物主要靠肾上腺皮质类固醇激素类，抗代谢药MTX等，环孢素A、维生素A酸、中药等，虽均有效，但往往是只对症，难以治愈61。因为银屑病本身即为一种多基因遗传性自身免疫性疾病。RHIL一11通过影响巨噬细胞、T细胞功能，减少免疫性炎性细胞因子释放，使失衡的免疫调节系统重新恢复正常，而起到治疗自身免疫病的作用7L【8119111，这对银屑病治疗首次开辟了细胞因子疗法，也是重组细胞因子首次通过调整免疫系统功能而治疗银屑病61，也开辟了RHIL一11的临床新用途。同时也将为把RHIL1L开发成新型抗银屑病药物打下良好理论基础。有望把本品开发为一个用于治疗银屑病的新型类新药。山东大学硕士学位论文实验材料一、药品与材料1重组人白细胞介素一11齐鲁制药厂生产批号20020301。2甲氨喋呤上海华联制药有限公司生产批号030201A。3兔抗小鼠细胞间粘附分子INTERCELLUARMOLECULE，ICAM1AGHESION单克隆抗体，武汉博士德生物工程公司产品。4正常山羊血清武汉博士德生物工程公司产品。5生物素化羊抗兔IGG武汉博士德生物工程公司产品。6小鼠IL一2ELISA试剂盒，晶美生物工程有限公司产品批号20030405。7甲醛溶液济南化工厂产品，批号960420。9乙醇无水乙醇济南巨业化工有限公司生产，批号20020315。10地塞米松山东鲁抗辰欣药业有限公司生产批号20030516。11秋水仙碱云南植物药业有限公司生产批号20030301。12TNFNTUMORNECROSISFACTORA放免测定试剂盒北方生物技术研究所提供批号03100L031205CELLNUCLEAR14PCNAPROLIFERRATINGANTIGEN单克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司提供批号SA202415SABC试剂盒武汉博士德生物工程有限公司提供16DAB显色试剂盒武汉博士德生物工程有限公司提供医药集团上海化学试剂公司产品批号F2003029020503二、基本仪器LTGL一16G型冷冻离心机上海安亭科学仪器厂生产2L880型低温超速离心机美国BECKMAN公司产品山东大学硕I学位论文3UV2102PCS型紫外可见分光光度计尤尼柯上海仪器有限公司生产4CHL3213型光学显微镜日本OLYMPUS产品5恒温水浴箱上海医疗器械三厂生产6超声破碎仪日本SONY公司产品7切片机德国LEIZE公司产品8旋涡混合器江苏海门其林医用仪器厂9GD一91L放射免疫计数仪中国科技大学创新股份有限公司中佳分公司生产10电子分析天平北京赛多利斯天平有限公司生产三、实验动物清洁级昆明种小白鼠，雌雄兼具其中雌激素周期小鼠阴道上皮实验阶段动物模型全部为雌性，体重23259之间，由山东大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号鲁动质20021015。9山东火学硕士学位论文实验方法一、药物对小鼠尾部皮肤颗粒层生成和相关细胞因子含量的影响取体重23259昆明种雄性小鼠若干只，实验室条件适应性喂养一周后，随机分为5组，因小白鼠尾跟表皮天然缺乏颗粒层细胞而类似银屑病角化不全病理相同体积的生理盐水。SC，每次给药容积为02MLLOG，恰好符合要求的实验剂量每日1次给药，共14天。在给药前及给药第7天、14天分别测体重，末次药后24H摘眼球取血处死小鼠取距鼠尾根部约15CM处的背部皮肤一长条。10福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色，在光学显微镜下观察每个标本的鳞片表皮有无颗粒层形成，凡鳞片表皮有连续成行的颗粒细胞形成者判定为有颗粒层的鳞片，计数每100个鳞片中有颗粒层形成的鳞片数。血清IL一2含量的测定每组小鼠于处死前以摘除眼球法取血约15ML，注入空白的离心管中静置15分钟后，2000RPM离心20分钟，4“C，分离收集血清后，采用IL2ELISA试剂盒及酶联免疫检测仪测定血清中的水平。拯查蝗塞1收集血液的试管为无热原和内毒素试管。2血浆抗凝剂应用EDTA。3避免溶血，高血脂标本。4标本应清澈透明，悬浮物离心去除。5标本收集后按一次用量分装，冻存于20，避免反复冻融。6根据实际情况，先将标本做适当倍数稀释做预实验以确定稀释倍数。捡型煎准备王往1_提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。2将浓缩洗涤液4用双蒸水稀释。未用完的放回4。LOI东人学颂L学位论义3标准品加入标准品标本稀释液1B1OML至冻干标准品1A巾，待彻底溶解后，静置15分钟混匀浓度为2000PGM1。然后根据需要进行稀释。拯韭些线焦旦丝王邀医；垫QQQ1212QG纽。复溶未用完标准品放入一20。C保存，稀释的标准品若未用完不重复使用。4检测剂工作液按实际用量以酶结合物稀释液3B按照标签所示稀释浓缩酶结合物3A1100，混匀后再以此液体按照标签所示稀释浓缩生物素化抗体2A1500。此工作液配制临用前15分钟时配制。洗涤方法1自动洗板机注入的洗涤液为350U1注入与吸出间隔1530秒。沈板4次。2手工洗板甩尽孔内液体，每；LDD沈涤液350UL，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。握佳生竖1从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回4“C。2除空白孔女外，分别将标本或不同浓度标准品100ULTB加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温1825。C孵育120分钟。3沈板4次。育60分钟。5沈板4次。山东大学硕士学位论文6加入显色剂100UL孔，避光室温10一15分钟。视显色深浅灵活掌握7加入终止液100UL孑L，混匀后即刻测量OD。值5分钟内。空白孔仅加入底物和终止液，单波长检测时用以校准酶标仪的基准点。使用双波长检测可以不设。绮墨刿堑1每个标准品和标本的OD值减去零孔的OD值。2手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接MIL2标准臆线H0A。1B1_2N8FK6M4Q2J2PGML各标准品的坐标点。通过标本的0D值可在标准曲线上查出其浓度。若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。二、药物对雌性小鼠明道上皮细胞有丝分裂的影响取体重23259昆明种雌性小鼠若干只，随机分为6组，即NS组，模型组，MTX阳性对照组，RHTL11高、中、低剂量组。除NS组IPNS外，其余组均IP己烯雌酚02MG只，QD，连续3天，3天后隔日1次IP己烯雌酚，并各组同时药，共12天。第12天上午各组均注射秋水仙碱2MGKG，6H后，处死动物并解F2山东丈学硕士学位论文剖取组织，10福尔马林固定，乙醇常规脱水，石蜡包埋，HE染色。在光学显微镜下观察计数300个基底细胞中有丝分裂的细胞数，然后算出各给药组有丝分裂指数。进行组间双尾T检验比较。免疫组织化学方法检测阴道组织中PCNA的表达MOLL各组小鼠阴道组织浸于4多聚甲醛中固定18小时后，先后置于01次浸入氯仿中约25小时、氯仿石蜡中约05小时、软腊中45分钟、硬腊中45分钟浸腊。最后进行石蜡包埋，阴道组织作垂直于切面的固定。腊块常温过夜，次日自包埋器中取出。常规石蜡连续切片，切片厚度约6UM，每张玻片上捞取连续切取的切片35张。捞片后置于55温箱中24H，使切片粘贴紧密，再置于4。C冰箱内保存备染。免疫组织化学染色，采用SABC法进行免疫组织化学染色。1切片置于5860温箱中预热过夜；2脱腊切片放入60二甲苯I中1小时，再放入常温下二甲苯II中30分钟70酒精中各510分钟；4灭活内源性过氧化物酶的活性置于蒸馏水新鲜配置的3过氧化氢中室温孵育510分钟。蒸馏水冲洗三次，每次3分钟5抗原修复滴加即用型复合消化液，37消化10分钟，以暴露在固定过程中被多聚甲醛分子交联封闭的抗原，001MOLLPBS冲洗三次，每次5分钟；6封闭非特异性抗原滴加正常山羊血清封闭液，37孵育30分钟，以减少非特异性染色之后甩去多余血清，不洗；7滴加一抗同一张玻片上不同切片依次滴加001MOLLPBS阴性对照、I100稀释的兔抗小鼠PCNA抗体，置于湿盒内保持切片湿润，于412冰箱过夜，001MOLLPBS冲洗三次，每次5分钟；山东人学坝FJ学化论义PBS冲洗三次，每次5分钟LO分钟；10DAB显色取LML蒸馏水，加DAB显色试剂盒中的A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片。于室温下避光显色530分钟，镜下控制显色时间，出现深棕色显色后以蒸馏水漂洗中止反应。II、100I、100II酒精中各5一10分钟；12透明、封片一_甲苯I、二甲苯II中各20分钟，中性树胶封片。免疫组织化学染色结果分析在2020光镜下，以阳性染色的单个上皮细胞簇为一个阳性标记，每例观察切片L张，于丰富区随机选取5个相互非重叠视野进行观察。采用双盲的方式在光学显微镜下观察切片各部位着色深浅，阳性部位为棕黄色，将染色结果分为强阳性、阳性、弱阳性、阴性一四个等绒。每组切片中以PBS缓冲液代替抗进行反应的对照片染色均为阴性着色。定量分析及统计学处理将免疫组织化学染色结果输入图像分析系统MPIAS1000，每个时帕J组随机选取5张组织切片，每张切片随机选择5个不同的视野，经屏分割和滤波等处理，分别测量各组切片中阳性部位的相对含量灰CAL度值，根据公式ODLOG空白坎度标本灰度计算出平均光密度MEANOPTIDENSITY，MOD值和S值，结果用平均光密度表示，并绘出直方图以显示变化趋势。组间比较根据各组阳性部位的平均光密度进行T检验分析。三、药物对2，4二硝基氟苯DNFB致小鼠耳部皮肤接触性过敏性皮炎的影响取体重23259昆明种小鼠若干只，随机分为5组，即NS组，阳性对照组地塞米松05MGKG，RHLL一11高、中、低剂量组RHLLLL低剂量组375UGKG，两耳圆片，称重后计算两耳重量之差，作为肿胀程度MG，行组间T检验比较。然后处死动物并取两侧耳廓组织，10福尔马林固定，乙醇常规脱水，石蜡包埋，HE染色。在光学显微镜下进行组织学检查，观察计数炎性细胞数，判断炎性反山东大学硕士学位论文应程度。并进行组间双尾T检验比较。同时进行多种相关因子的含量测定。1耳朵皮肤组织中ICAM一1的测定1取材每组取12只动物，取等面积的完整左、右双耳皮肤组织，将其放入4甲醛溶液固定20H后经30蔗糖溶液4多聚甲醛配制脱水过夜，一70Y液氮冷冻，石蜡包埋，组织标本置于低温恒温切片机上行连续冠状切片厚5UM。2免疫组织化学方法检测细胞间粘附分子ICAM1的表达石蜡切片常规脱蜡至水，3过氧化氢室温孵育LOMIN，以消除内源性过氧化物酶的活性。然后蒸馏水冲洗5MINX3次。切片上滴加复合消化液，室温下处理LOMIN。再次用蒸馏水洗涤5MINX3次。用非免疫血清即山羊血清封闭，室温孵育20MIN，倾去，不洗。滴加一抗即兔抗小鼠ICAM1单克隆抗体工作浓素化羊抗兔IGG，37“C孵育30MIN，PBS冲洗3MINX3次。再滴加链霉菌抗生物显色，室温下放置20MIN。自来水充分冲洗，苏木素复染，0037,醇脱水，二甲苯透明、封片，光镜观察。阴性对照用PBS代替一抗孵育。在20X20光镜下，以阳性染色的单个上皮细胞簇为一个阳性标记，每例观察切片1张，于丰富区随机选取5个相互非重叠视野进行观察。评定标准同上法PCNA检测法中定量分析及统计学处理ICAM1的表达结果。2血清中NO含量的测定1样品采集每组小鼠于处死前以摘除眼球法取血约15ML，注入空白的离心管中静置15分钟后，2000RPM离心20分钟，42D，分离收集血清后，放入一20。C冰箱保存。2原理NO化学性质活泼，在体内代谢很快转为N毡一和N03一，而N02一又进一步转化为N0，一，本法利用硝酸还原酶特异性将NO。一还原为NO一，通过显色深浅测定其浓度的高低。3测定方法按照试剂盒说明书进行，加液程序见下表山东大学硕士学位论文血清NO测定程序表空白管标准管测定管O1双蒸水M1标准应用液M101样本M1O102试剂一M1020202试剂二M10202混匀，37“C准确水浴60分钟试剂三M1020202O1试剂四M1O101充分漩涡混匀30秒，室温静置10分钟，35004000转份，离心LO分钟，取上清显色上清M1050505显色剂M1060606混匀，室温静置LO分钟，蒸馏水调零，550NM，05CM光径，测定各管吸光度值说明标准应用液的配制取01ML标准品用双蒸水定容稀释至LOML即100倍稀释，混匀，即为1001TMOLL标准应用液。4结果计算依下列公式计算血清中N0含量0含量测定管吸光度一空白管吸光度标准品浓度样品测试前MOIL标准管吸光度一空白管吸光度稀释浓度100,UMOLLJLA说明标准品浓度为100MOLL，NO含量单位为扯MOLL。3小鼠血清白介素一6、肿瘤坏死因子吐的放射免疫学检测均采用液相平德竞争放射免疫分析法RADIOIMMUNOASSAYRIA。1样品采集每组小鼠每组取12只于处死前以摘除眼球法取血约15ML，静置15分钟后，2000RPM离心20分钟分离收集血清，并置于一20冷冻保存备用。2检测前的标本处理将冷冻保存的血清标本取出，于室温下平衡。对于有沉淀产生的标本，先进行平衡、混匀，然后于4“C2000RPM离心20分钟，取上16山东大学硕士学位论文清。0、10、50、100、250、LOONGML；标准品“ITNFA的七个倍增浓度为B,BD750、2000PGM1；标记物所含总放射性5OKBQML。4加样采用双管平行加样法，以便取平均值减小误差，在2MLEPPENDORFL。离心管中依次加入以下溶液，加样单位为U放射免疫加样表总T每分NSB非特B0钟脉冲B1吨标本管异性管数反应稀释200200液200标准液200待测样品水200200200200抗体5迅速盖上塞子，振荡混匀，置于4黑暗中反应45分钟后。6取下盖子，各管均加入标记物标记抗原20011L，盖上盖子，震荡摇匀，室温下反应30分钟。U7各管加入分离剂各10001，充分混匀，分离抗原抗体复合物与未结合的抗原。43600RPM离心20分钟，取下盖子，倒掉上清液，将离心管口朝下，在几层吸水纸上面上下轻微甩打几次，甩掉残余的液滴。8加入200UL双蒸水，溶解沉淀物。9加入闪烁液，盖上盖子，摇匀。用自动Y一计数仪测量各管沉淀物的衰变率，绘制标准LOGLOGIT线性回归曲线，并根据曲线查出样品中自介素一6和组织坏死因子A的含量。四、数据统计学处理所有数据均用MEANSOXS表示，采用组间T检验分析进行统计学处理，P005作为显著性差异界值。7山东大学硕士学位论文实验结果一、对小鼠体重的影响见表1，对照组在实验过程中体重变化不大，RHILIL低、中、高三个剂量组在用药过程中体重变化不明显，说明药物对小鼠生长无明显不良影响。表1RHIL一11对小鼠体重的影响GN12，；士S二、对鼠尾表皮颗粒细胞形成的影响见表2，结果表明RHIL11各剂量组和甲氨喋呤均可促进鼠尾鳞片表皮颗粒层的形成，与空白组比较有显著性差异PO01。表2RHIL11对鼠尾表皮颗粒细胞形成的影响N12，；5注P0OL与空白组相比三、对小鼠血清IL一2水平的影响见表3，结果表明RHIL11各剂量组和甲氨喋呤均可降低小鼠血清IL一2的山东大学硕士学位论文组别样本含量只剂量MGK91血清IL一2PGM1注P005料PO01与空白组相比四、对雌性小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响见表4，结果表明模型组与空白组相比有显著性差异PO01，说明造模成功。同时可看出RHIL一11各剂量组和甲氨喋呤均可抑制小鼠阴道基底细胞的有丝分裂，与空白组比较有显著性差异P001。RHIL一1表4L对小鼠阴道基底细胞有丝分裂率的影响N12，；曲注PO01与模型组相比料P001与空白组相比五、阴道上皮组织细胞增殖细胞核抗原PCNA表达的测定应用免疫组织化学方法检测发现，模型组小鼠有明显的PCNA阳性染色高有中度表达的PCNA。阳性反应部位主要以基底细胞核为主，表现为棕黄色深染。J9山东大学硕士学位论文PIAS将免疫组织化学染色结果输入图像分析系统M1000。用平均光密度表示。结果见表5和照片。表5RHIL11对小鼠阴道上皮细胞增殖细胞核抗原表达的影响N12；S注PO01与模型组相比十P001与空白组相比六、对DNFB性小鼠接触性迟发性皮炎模型的影响结果表明，地塞米松组及RHIL11高、中剂量组可明显抑制DNCB致耳部肿胀程度，并且能够明显减轻接触性迟发性炎症反应，降低皮肤中炎性细胞浸润数。结果见表6与表7。表6RHIL11对DNFB性小鼠接触性迟发性皮炎模型的影响N12，；S注P001与空白组比P005PO01与模型组比山东大学硕士学位论文表7注PO05PO01七、对DNFB性小鼠接触性迟发性皮炎模型ICAML表达的影响、应用免疫组织化学方法检测发现，模型组小鼠有明显的ICAML阳性染色高量组有中度表达的ICAML。阳性反应部位主要以细胞膜及其周围区域的微血管PI为主，表现为棕黄色深染。将免疫组织化学染色结果输入图像分析系统MAS1000，用平均光密度表示。结果见表8。表8注POOL与模型组相比料POOL与空白组相比八、对DNFB性小鼠接触性迟发性皮炎模型NO含量的影响结果表明，地塞米松与RHLLII高、中、低剂量均降低接触性迟发性皮炎模型小鼠血清中NO的含量。2I山东大学硕士学位论文表9注十PO01与模型组相比料PO01与空白组相比九、对DNFB性小鼠接触性迟发性皮炎模型血清中TNFN含量的影响见表10，结果表明RHIL11高、中剂量组和地塞米松均可明显降低小鼠接触性迟发性皮炎模型血清中TNFN的含量，与空白组比较有显著性差异表LO注替PO01与空白组比木水P005，PO01与模型组比十、对DNFB性小鼠接触性迟发性皮炎模型血清中IL一6含量的影响见表11，结果表明，地塞米松可明显降低小鼠接触性迟发性皮炎模型血清山东大学硕士学位论文PO05。表11RHIL11对小鼠接触性迟发性皮炎模型血清中IL一6含量的影响N12，；士曲注棹PO01与空白组比木PO05，料PO01与模型组比山东大学硕士学位论文讨论银屑病为一种常见的自身免疫性炎性和增殖性皮肤病。人群发病率约2，治愈率低且极易复发。目前国内外用于治疗本病的药物主要靠肾上腺皮质类固醇激素类，抗代谢药MTX等，环孢素A、中药等，虽均有效，但往往都是对症，难以治愈。并且目前常用治疗本病的有效药物毒性均较高，限制了其I|缶床长期应用，某些抗代谢药长期应用甚至可诱发再障、白血病等。众多研究显示新型生物制剂RHLL11具有抑制或对抗与银屑病密切相关的一些细胞因子、可纠正失衡的免疫调节功能、减轻炎症反应的作用【7】【81135】口6】【37】，从而从源头上可对本症进行治疗。并且本品已被我国于2003年将其作为I类新生物制剂药物批准投产面市，主要用于治疗肿瘤化疗所致的血小板减少症，其毒性相比其它药物低的多。因此，在治疗银屑病方面，RHIL一11是一个可能具有广阔应用前景的药物。银屑病的病因除与遗传、感染、应激等因子相关外，免疫调节机能失衡是引起病理损伤的主要机制【2】131。在本病发病过程中，R细胞功能低下，T。细胞和B细胞功能亢进，ICAM一1、ELAM一1、VCAM一1、转谷酰胺酶等多种细胞因子释放，而诱发或加剧病灶炎症及皮肤损害【4。近年研究表明，在R细胞中，又分为THL和TH2两种细胞，THL细胞主要介导细胞免疫和炎症反应，可分泌IL一2、IFNV等促炎因子诱发或加剧本病，同时抑制TH2细胞扩增和释放IL一4、IL一10等抗炎因子。而TH2细胞主要参与B细胞增殖，可分泌IL一4、IL一10等抗炎因子而抑制THL细胞扩增和释放促炎因子。抗原递呈细胞抗原递呈细胞APC可以看成是免疫反应的启动因子之一，导致银屑病的临床表现。APC是一组对抗原依赖性T细胞的活化与增殖必不可少的特殊性辅助细胞。它通过II类主要组织相容性复合物MHC分子的抗原结合槽与抗原结合，将抗原递呈给T细胞。通过T细胞对MHC分子和抗原的识别来决定抗原递呈的特异性。此外，诸如细胞间粘附分子一1ICAM一1这类细胞表面粘附分子和诸如在APC中表达B7这类协同刺激辅助分子必须与T细胞表面各自的配体，化四】【13L。山东大学硕_学位论立角朊细胞多年来一直认为特征性的表皮过度增生是银屑病的最初改变，从而考虑到银屑病角朊细胞存在着内在异常，并广泛进行了研究。正常皮肤中处于静止状态的干细胞亚群在银屑病中活跃增殖，导致该病特征性的表皮过度增生。有关T细胞一角朊细胞间相互作用的另外迹象是在表皮内的绝大多数T细胞是处于活化状态，表达有一种周期性细胞特异性抗体KI一67，而95的真皮T细胞KI一67阴性，表明处于休止的非周期状况，这意味着T细胞进入表皮是一个重要的活化过程。CD4T细胞分泌的IFNY可诱导角朊细胞的ICAML和MHCI的表达，促进T细胞的粘附和抗原表达。IFNL也许对T细胞进入表皮起着重要的作用【”。T淋巴细胞很多迹象表明辅助性T淋巴细胞在银屑病的发病机理上起到关键性作用【141”】。银屑病的真皮浸润中含有大量的T淋巴细胞和巨噬细胞少量的B淋巴细胞和个性粒细胞。皮损中的CD4CD8比率高于血液中的比率，提示银屑病皮损中CD4T细胞增多。点滴状皮损的自然消退与皮损内CD8T细胞的1细胞的减少有关。银屑病角朊细胞的异常高度依赖于T淋巴细介入和DR”CD4胞及其分泌的细胞因子。应用两种选择性T细胞免疫抑制刑环泡素和FK506可使疾病得到明显改善以银屑病患者作为供体的骨髓移植受体可发生银屑病，而同种异体骨髓移植后疾病可以消退，以及应用抗CD4CD3单克隆抗体可使症状得到改善都充分证明T淋巴细胞在银屑病发病中的关键性作用。CD4T细胞产生的细胞因子是类小的多肽类物质，发挥化学信使作用，具有多种调节功能。银屑病皮损中T淋巴细胞产生的细胞因子是I型T辅助细胞TH1的细胞因子，即IL2，IFNL和组织坏死因子TNFD等。内皮细胞在活动性银屑病皮损中，真皮和表皮炎症性浸润的白细胞来自周围的血管。白细胞聚集这一过程包括白细胞和内皮细胞间的一系列高特异性的相互作用，并由细胞粘附分子的表达进行调节112L【13】【16L。细胞粘附分子有3组选择素，包括膜L_选择素，E一选择素和P选择素；免疫球蛋白超基因家族，包XSLEX的结损的内皮细胞中增加的E一选择素通过与白细胞表面抗原唾液LEWIS合而对中性粒细胞，嗜酸粒细胞和单个核细胞起到配体的作用。在内皮细胞上表山东大学硕士学位论文皮细胞间的相互作用。整合素在增强T细胞粘附方面起着重要的作用，从而分别与ICAM一1，ICAM2和VCAM1结合而活化内皮细胞。白细胞介素2IL一2是T细胞和NK细胞产生的糖蛋白，在机体的免疫应答CELL中起重要作用。MORGAN等人首先报道的是T细胞生长因子TGROWTHCELL名称包括T细胞替代因子TREPLACINGFACTOR，TRF、T细胞促分裂因CELL子TMITOGENICFACTOR，TMF、淋巴细胞条件培养液1YMPHOCYTECONDITIONEDMEDIUM，LCM和杀伤辅助因子KILLERHELPER号，IL一2与IL一2R的结合对于T细胞的活化与增殖起着至关重要的作用。T细胞活化后产生的细胞因子作用于角质形成细胞，使其过度增殖。另外IL一2还可MS。IL一2最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖从G。期进入S期和分化。人胸腺中的T细胞前体表达IL一2R0并分泌低水平的IL一2，这种自分泌作用可促进胸腺细胞增殖。IL一2参与调节T细胞受体基因的重排和表达。IL一2能诱导NK细胞增殖，增强NK细胞的活性，诱导LAK细胞和TIL，并刺激它们产生细胞因子。高剂量IL一2能引起单核巨噬细胞增殖和分化，并增强单核巨噬细胞杀肿瘤细胞的作用。IL一2也能刺激已活化的B细胞增殖，活化B细胞表达高亲和力IL一2受体U7】，其中A链由B细胞促分裂原诱导表达，而B链由IL2或IL一4诱导表达。IL一2除了支持B细胞生长外，还能促进免疫球蛋白IGM和IGG分泌，诱导J链合成从而加速IGM的装配和分泌。IL2还刺激少突神经胶质细胞产生髓碱性蛋白，对该种细胞的增殖则呈双向性调节。在体内，IL2有抗肿瘤、抗微生物感染、引起移植排斥和自身免疫以及免疫调节等作用【18L。可溶性IL一2R作为免疫抑制剂，对白血病、移植排斥和自身免疫病可能有治疗作用。因此，本研究将其作为一个重要的观察指标，在小鼠尾部鳞片表皮模拟银屑病角化不全实验中，发现RHLL一1L各剂量组和甲氨喋呤均可降低小鼠血清IL一2的水平，鼠尾鳞片表皮颗粒层的形成也得到增加，提示RHIL11可能通过降低IL一2的水平及其它可能途径来缓解银屑病角朊细胞分化不良的病症。IL一6是一种多源性细胞因子，目前已知多种淋巴细胞和非淋巴细胞可自发和26山东大学硕士学位论文在不同刺激下产生IL一6。正常人角朊细胞和表皮癌细胞株是近年来得到证实的能角朊细胞合成转化生长因子TGF，通过与表皮细胞表面的表皮生长因子EGF受体结合，促进细胞增生。因此银屑病角朊细胞产生的IL一6又是角朊细胞的有丝分裂原，与其它因素协同作用可诱导和促进角朊细胞的过度增生。此外IL一6对银屑病皮损的炎症形成，增加T细胞在表皮内的聚集具有一定的促进作用。已有资等观察到银屑病皮损的IL一6，高于患者非皮损区和正常人皮肤。局部IL6的异常与银屑病的发生和发展密切相关【19L。外周血单个核细胞经PHA和LPS刺激后分泌IL一6的能力增加，IL一6能刺激体外培养的人角朊细胞增生。人的角朊细胞能合成、分泌IL一6。银屑病治疗有效时，吸疱液中的IL6水平下降，在银屑病斑片皮损获得的疱液中的IL一6水平明显增高。在未受累皮肤获得的疱液中的IL6水平又比正常皮肤要高，血清IL一6水平低于疱液【201提示IL一6可能由局部产生。本实验测得RHIL一1L高剂量应用时方可降低血清中IL一6的水平，且仍明显高于正常组，而结合其他实验结果又显示RHILLLNI降低IL一2、TNFQ、NO等因子的含量，而1这些因子又与IL一6密切相关，甚至都可刺激促进IL6的水平增高，提示RHILL直接对IL一6的影响变化不大，可能增大剂量后通过间接途径较明显降低IL6水平从而影响其功能。肿瘤坏死因子一ATNFA是一种多效应细胞因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，LPS是较强的刺激剂。R干扰素IFNY、巨噬细胞集落刺激因子MCSF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GMCSF对单核细胞巨噬细胞产生TNFQ有刺激作用，而前列腺素EPGE则有抑制作用。前单核细胞系U937和前髓巴细胞、T细胞杂交瘤、T淋巴样细胞系和NK细胞等在PMA刺激下也可分泌TNF外，中性粒细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞LAKCELL、星状细胞、内皮细胞和平滑肌细胞亦可产生TNFA。人的TNFA基因与主要组织相容性复合体MHC基因群密切连锁，定位于第6对染色体上。其前体由233个氨基酸残基组成，含信号肽切除信号肽后成熟型TNFN为157个氨基酸残基，非糖基化，第69位和101位两个山东大学硕士学位论文半胱氨酸形成分子内二硫键。TNFD的生物学作用似无明显的种属特异性，其发挥生物学效应的天然形式是同源的三聚体。它除了具有杀伤或抑制肿瘤细胞的生物学活性外，还具有其他许多生物学活性，特别是促炎症作用及免疫调节作用。TNFN的生物学活性是通过与TNF受体TNFR结合而达成的，其受体分为两型I型，分子量55KU，439个氨基酸残基，此型受体可能在溶细胞活性上起主要作用II型，分子量75KU，426个氨基酸残基，此型受体可能与信号传递和T细胞增殖有关。TNFR存在于多种正常及肿瘤细胞表面，一般每个细胞受体数目有103104。TNFA与相应受体结合后信号传递的机制尚不清楚，可能与活化蛋白激酶CPKC、催化受体蛋白磷酸化有关。银屑病是一种常见多发性慢性炎症性疾病，其组织病理学以角质过度角化及角化不良、表皮过度增厚以及真皮炎细胞浸润为主要表现。病因和发病机制尚不十分清楚，主要考虑与遗传、感染、代谢障碍、内分泌等因素，特别是与免疫有关。1987年，GOERDT等发现免疫细胞因子TNFA能诱导银屑病患者内皮细胞活化后，越来越多的研究表明TNFA与银屑病关系化学方法分析了正常人、银屑病患者皮肤损伤及非皮肤损伤区皮肤中TNFA及TNFN受体的分布情况。在正常皮肤组织中，TNFN主要分布于表皮基底细胞层、小汗腺导管及皮脂腺周围而在皮肤损伤及邻近的非皮肤损伤组织中，TNFA则广泛分布于表皮全层，同时也特异性地分布于真皮上层的血管周围。对于正常皮肤及非皮肤损伤组织，P55TNFR主要分布于表皮角朊细胞及真皮上层的树突状细胞中而在皮肤损伤中，P55TNFR除上述的分布外，同时还分布于角化不全的角质层及真皮上层的血管周围。P75TNFR在正常皮肤中局限于小汗腺导管及真皮树突状细胞而在皮肤损伤中，P75TNFR则分布于真皮上层血管及血管周围浸润的细胞中。这说明TNFA在体内对表皮细胞的作用是通过与受体P55结合而发挥的。免疫方法测定发现，银屑病皮肤损伤中TNFN的免疫反应性和生物学活性远远高于非皮肤损伤区中TNFCL的免疫反应性和生物学活性，应用抗TNFA单克隆抗体中和后表明，生物学活性完全是由TNFA单独表现出来的。银屑病患者不检测了患者皮肤损伤区及非皮肤损伤区中的TNFA含量，并与正常人皮肤中的含量进行对比。结果显示，TNFN在患者皮肤损伤中的含量显著高于患者非皮肤损山东大学硕士学位论文伤区及F常人皮肤中的含量，而且与疾病的严重程度相关，尤其与病人的红斑情况关系密切而患者皮肤损伤以及非皮肤损伤区中TNFQ的含量均显著高于正常人皮肤中的含量田L。在关节型银屑病患者中，随着病期的延长，关节常出现破坏、功能受损以至畸形。PARTSCH等比较了银屑病性关节炎PSA、类风湿性关节炎RA和骨关节炎OA关节液中细胞因子的水平，结果发现，PSA关节液中TNFA等的含量均高于OA关节液中的含量，但低于RA关节液中的含量。随后的试验也证实了这一观点，由于这些促炎性细胞因子在PSA及RA关节液中的表达方式很相似，因此认为，这些细胞因子尤其TNFQ和ILL是引起PSA及RA关节破坏的主要因素。TNF一11在血清中的含量报道不一。BONIFATI等试验表明，病人血清中TNFN的含量明显高于正常对照【24】。TNFD在银屑病发病中可能的作用机制有，角朊细胞在银屑病病理改变中主要表现为过度增殖和异常的分化，在这一过程中蛋白酶抑粉USKALPSKINDERIVED之一，人们将SKALP的表达作为表皮角朊细胞再生分化的一个标志，对它的产生和调节作一研究。结果发现，TNFA无论是在MRNA水平还是蛋白水平均能诱导SKALP的表达，说明TNFO可以影响角朊细胞的再生分化，是银屑病病理形成的一个基础【2”。此外，角朊细胞生成的弹性蛋白酶抑制剂ELAFIN在银屑病皮肤损伤的角层下是过度表达的，它可导致表皮中中性白细胞的浸润，这是银屑病病理中的又一典型表现，而TNFO能刺激角朊细胞分泌ELAFIN增加。成纤维细胞功能改变被认为与银屑病的发病机制有关，将取自患者皮肤损伤及正常人皮肤的成纤维细胞分别进行培养，然后用TNFA进行刺激。应用ELISA方法检测培养上清中的IL一6。结果发现，患者的成纤维细胞分泌的IL一6在TNFA刺激前后均比正常人的为低。这说明银屑病成纤维细胞产生IL一6的能力低于正常人，而TNFA能够诱导成纤维细胞这一表型的改变【2“。另外，细胞粘附在炎症的发生及调节中发挥重要的作用。在银屑病的角朊细胞中细胞间粘附