正交试验设计优化太行菊的提取工艺 毕业论文

正交试验设计优化太行菊的提取工艺张艳茹生命科技学院生物工程064班引言太行菊OPISTHOPAPPUSTAIHANGENSIS是菊科太行菊属的多年生宿根草本植物，多年生草本，高1015厘米；根垂直直伸，在根头顶端发出少数（12个）或稍多数的弧形弯曲斜升的茎。茎淡紫色或褐色，被稠密或稀疏的贴伏的短柔毛。基生叶卵形、宽卵形或椭圆形，长2535厘米，规则二回羽状分裂，一、二回全部全裂。一回侧裂片23对。茎叶与基生叶同形并等样分裂，但最上部的叶常羽裂。全部叶末回裂片披针形、长椭圆形或斜三角形，宽L2毫米。全部叶两面被稀疏或稍多的短柔毛，基生叶的叶柄长13厘米。头状花序单生枝端，或枝生2个头状花序。总苞浅盘状，直径约15厘米。总苞片约4层，中外层线形和披针形，长455毫米，内层长椭圆形，长67毫米，中外层外面被稍密的短柔毛，内层无毛或几无毛。舌状花粉红色或白色，舌状线形，长约2厘米，顶端3浅裂齿。管状花黄色，花冠长28毫米，顶端5齿裂。瘦果长12毫米，有35条翅状加厚的纵肋。冠毛芒片状，46个，分离或仅基部稍连合，不等大亦不等长，最长的达1毫米，最短的长仅01毫米；全部芒片集中在瘦果背面顶端，而瘦果腹面裸露，无芒片。为太行山特有属，仅有2种，主要分布在河北邢台、武安、磁县山西陵川、晋城；河南林县、辉县、济源等地区，分布范围十分狭窄，多生于海拔1000M左右的山坡上以及悬崖峭壁的石缝中，生境险峻,人常难以到达植物体通体富含芳香油，干后香味持久太行菊入秋后花色洁白或粉红，花期长达34个月，耐旱、耐荫、耐寒,具有很高的观赏价值和药用价值1。关于太行菊属研究集中于杂交、以及组培扩繁等方面，而对于太行菊化学成分的提取的究尚未报道234。在河南济源地区，太行菊被当地居民作为菊花代替品，具有疏风、清热、明目、解毒功效,且效果比菊花更好5。菊花的主要含有黄酮类、挥发油类、酚酸类、氨基酸和糖类等活性物质67据研究表明菊花脑茎叶中也含有丰富的黄酮类物质10又有文献显示匹菊属中的藏西小黄菊的主要成分也有黄酮类化合物8,而太行菊属在分类学上归为菊科菊蒿亚族9，接近分布与欧洲、北非及其中亚地区的匹菊属,据此可以初步推断出太行菊中也含有黄酮类物质。近年来对具有生理活性的黄酮类化合物的研究越来越受到人们的重视，现代研究证明黄酮类化合物是重要的抗氧化剂,其生理作用是多种多样的例如芦丁、槲皮素等能够增强心脏收缩杜鹃素具有止咳祛痰作用黄芩苷具有抗菌消炎、抑制肿瘤细胞作用水飞蓟素具有保肝作用等11黄酮类化合物还有降血脂、止血、抑制血小板聚集等多种药理作用，是一类具有广泛开发前景的天然药物12。正是其上述生物活性引起了人们的广泛重视,对该类化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门课题131415。已分离得到的黄酮类化合物主要有香叶木素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、香叶木素7OD葡萄糖苷、芹菜素7OD葡萄糖苷、木犀草素7OD葡萄糖苷、金合欢素7OD葡萄糖苷等16此外，国内也有不少研究学者对不同产地、品种或者同一品种不同采收期菊花中黄酮类成分进行了提取工艺、含量测定、质量控制等方面研究。有人采用薄层层析和比色法，对亳菊、滁菊、贡菊和杭白菊的叶及花中总黄酮含量进行测定，结果表明菊花叶和菊花中的主要成分类似17，且太行菊为国家濒临灭绝的珍贵物种,故本试验课题选取太行菊的茎叶为试验材料,提取其中的总黄酮物质以总黄酮类化合物提取含量作为指标,研究与优化太行菊的提取工艺为对其化学成分研究，质量控制同时进一步将其黄酮类物质加工成有特异功能的保健食品和药品等产品奠定了基础。1仪器、材料和试剂11仪器752型紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；植物粉碎机；数控超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）。12材料试验材料太行菊（OPISTHOPAPPUSTAIHANGENSIS）采自河南省关山国家地质公园，由河南科技学院孟丽教授鉴定，标本（NOGS0901）现保存在河南科技学院植物学实验室。样品置烘箱内5060干燥24H,粉碎后过40目筛备用。13试剂芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，含量测定用），所用试剂亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠为分析纯，水为蒸馏水。2方法与结果21总黄酮的测定实验211最大吸收波长的选择以亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠为显色剂，分别作各样品提取液以及芦丁标准品的吸收曲线，在510NM处均有1个强吸收峰，因此选择510NM为测定波长。212对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品102MG置50ML容量瓶中，加适量甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。213标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1，2，3，4，5ML，分别置10ML容量瓶中，加入5亚硝酸钠溶液03ML，振荡摇匀，放置6MIN；再加入10硝酸铝03ML，振荡摇匀，放置6MIN；最后加入4氢氧化钠试液4ML，加甲醇定容至刻度，摇匀，放置15MIN。采用分光光度法，在510NM处测定吸光度，以对照品量M1为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。214黄酮含量测定方法吸取05ML供试液，加入5亚硝酸溶液03ML，振荡摇匀，放置6MIN；再加入10硝酸铝03ML，振荡摇匀，放置6MIN；最后加入4氢氧化钠试液4ML，加3OVV乙醇定容至刻度，摇匀，放置15MIN。采用分光光度法，在510NM处测定吸光度值，由标准曲线计算得总黄酮含量。22浸膏得率的测定精密移取太行菊提取液15ML，置于干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣于105干燥至恒重，取出，置干燥器中放置30MIN后称定重量。23工艺优选231提取方法称取若干份太行菊粉6G，分别用乙醇溶液在恒温水浴中加热浸泡，收集滤液。旋转蒸发仪减压蒸馏回收溶剂，得浓缩液，即提取的浸膏。膏液置烘箱内低温烘干，分别加60VV乙醇置水浴上溶解，过滤，洗涤至100ML容量瓶中，定容至刻度，摇匀。精密吸取1ML于10ML容量瓶中，加30VV乙醇定容至刻度，摇匀为供试溶液。232因素水平设以乙醇为溶媒，根据预试结果设计正交试验，对提取工艺进行优化，见表1表1因素水平设计水平ABCD溶媒浓度溶媒量/倍提取时间/H提取次数1501511270201523902523233正交试验称取太行菊8份，每份6G，按L934正交表的条件分别进行提取，过滤，合并滤液，适当浓缩或稀释，定容至100ML，离心，取上清液分别测定总黄酮含量和浸膏得率3结果与分析31标准曲线的制定通过NANO2A1NO33NAOH显色反应，在波长510NM处测定吸光度值（如表2），以OD值对标准溶液浓度得出标准曲线（如图1），用最小乘方回归法得直线方程A85049X00435R209994吸光度A为纵坐标，芦丁浓度C为横坐标。总黄酮含量以芦丁计，在002040102MG/ML范围内与吸光度呈直线关系。标准样品的检测结果，见表2。黄酮含量的标准曲线图，见图1。表2标准样品的检测结果样品浓度测定1测定2测定3平均值（G/L）00204012201220123012200408030903090309030900612048504830482048300816065406530657065401020816081608190817图1紫外分光光度计测定总黄酮含量的标准曲线图32试验结果321结果记录将太行菊的浸膏重量，浸膏得率，总黄酮的含量记录，并制成图表，见表3。其中浸膏得率浸膏重量样品重量100；总黄酮含量总黄酮重量样品重量100；表3太行菊提取工艺正交试验设计表及结果0010203040506070809000200400600801012浓度G/LOD值因素测定结果编号ABCD浸膏重量（G）浸膏得率总黄酮含量（）11111032534198212220518462153133305998725042123058962298522310386392326231204880265731320508342238321305286624593321039645221322直观分析法处理试验结果用直观分析法进行数据处理以表示第J个指标下的第I个测定值。I1，2NJ1，2K首先以各指标的最大值作为参照,对同一指标各数据进行标准化处理，D表示第J个指标下的第I个测定值的标准化数据，即DIJ100XIJXJMAX。计算各因素各水平下每种试验指标的数据和以及平均值，并计算极差R。结果见表4表4实验结果极差分析表编号ABCD浸膏得（DI1）总黄酮含（DI2）1111154106644212228574721531333100008390421239747100005223164747785623128105889373132845074883213877482219332165347416浸膏K123985236072228918418得率K224326238222485525129K323758246392492428521K17995786974306139K28107794182858376K37919821383089507R1883448783368总黄K122249241272375821845酮含K226678232212463123591量K323120246992365826611K17416804279197282K28893774082107864K37707823378868870R14774933241588323初选优化工艺条件3231最佳组合和最佳水平根据各指标不同水平平均值确定各因素的优化水平组合。浸膏得率（）A2B3C3D3总黄酮含量（）A2B3C2D33232确定主次顺序根据极差大小列出各指标下的因素主次顺序。浸膏得率（）DCBA总黄酮含量（）DABC3233制因素与指标趋势图以各因素水平为横坐标，试验指标的平均值为纵坐标，绘制因素与指标趋势图。由因素与指标趋势图可以更直观地看出试验指标随着因素水平的变化而变化的趋势，可为进一步试验指明方向。见图2，图3。324正交试验结果的方差分析表5正交试验的方差分析方差来源离均差平方自由均方F值F和度浸膏得率CD误差（AB）总黄酮A含量D误差（BC）15035931762375526807833341813539695179294224224751797881187867021667091176984844824112175F2,47711314832F2,4212371919394844325综合平衡确定最优工艺条件对于因素D，其对浸膏得率和总黄酮含量的影响大小都排第一位，故选D3因素A、B对于浸膏得率和总黄酮含量的最佳选择一致，应选A2、B3因素C,最佳选择为C2或者C3，但是因素C对于浸膏含量的影响，为主要因素，而对于总黄酮的含量的影响排最后，为次要因素，故应最佳选择为C3。最后确定最佳优化组合为A2B3C3D3326验证试验取太行菊粉末6G，置于提取容器内，按已确定的最佳提取工艺A2B3C3D3，进行3批验证试验表6太行菊提取工艺的验证试验样品号浸膏得率（）总黄酮含量（）123980976984293299290表4结果表明验证试验结果为浸膏得率980004,总黄酮含量（293006）。验证结果与正交试验结果相近，确定该提取工艺基本稳定、可行。图2因素与指标趋势图0102030405060708090100ABCD因素水平浸膏得率0102030405060708090100ABCD因素水平总黄酮含量图3因素与指标趋势图4讨论以太行菊总黄酮提取液在510NM波长处的吸光度为参考指标，通过总黄酮提取工艺的正交试验研究，确定了从太行菊中提取总黄酮的最佳条件为以70乙醇为溶剂，料液比为120，提取3次，每次2H，提取处理太行菊6G。通过稳定性实验，确定总黄酮至少在24H内是稳定的。该提取方法操作简便，结果准确可靠。为进一步研究太行菊中总黄酮提取工艺提供理论依据。太行菊含有丰富的黄酮，具有广泛开发和利用价值，值得综合利用，应该加强其资源开发。由于太行菊化学成分较为复杂，因此采用单一指标进行工艺优化有失偏颇，而采用多指标进行工艺筛选，有利于兼顾各指标的综合效应，以及对结果的正确分析，易于发现较优方案18。本试验采用多指标正交试验对方案中的各测定指标进行分析，比单一指标更合理、科学。但是本试验还存在以下需要改进的方面，具体体现在（1）本试验的提取方法采取的是较为传统的有机溶剂浸泡法，虽然此法简单，使用范围较广，但是提取效率较低。近年来出现了较为有效的提取方法，如超声波提取法，微波提取法192021等，可以在最佳工艺条件下，进行方法的改进。（2）本试验的结果处理采用的正交试验直观处理法，对于多指标试验而言，精确度不是很高，可以配合方差分析，进行最佳组合的选择。参考文献1国家药典委员会中华人民共和国药典（一部）S北京化学工业出版社，20052182李健，陈发棣，陈素梅，等太行菊和芙蓉菊花粉母细胞减数分裂过程J南京农业大学学报，2009，32443463姚连芳，董美华，毛玉收太行菊组织培养研究J，中国农学通报，20040629314王建博，徐思明，董鹏，等太行菊顶芽离体高效再生系的建立J,首都师范大学学报,2008,290545505石铸太行菊属中国菊科植物一属J植物分类学报，1979，17（03）1111136张晓媛，段立华，赵丁菊花化学成分及药理作用的研究J时珍国医国药,2008,1907170217047张清华,张玲菊花化学成分及药理作用的研究进展J食品与药品,2007,90260638杨爱梅,鲁润华,师彦平藏药川西小黄菊化学成分的研究J中成药,2008,30057317339BREMERK，HUMPHRIESCJGENERICMONOGRAPHOFTHEASTERACEAEANTHEMIDEAEJBUL1NATHISTMUSLONDON，1993237117710杨念云,任爱农，胡万春,等菊花脑嫩茎叶的化学成分J中国农业大学学报，2005，36540240411肖常厚中药化学M上海上海科学技术出版社,199726512李莉,刘成梅,田建文,等现代提取分析技术在黄酮类化合物中的应用J江西食品工业,20064424413曹纬国，刘志勤，邵云，等黄酮类化合物药理作用研究进展J西北植物学报，2003，23122241224714刘蕊黄酮类化合物的药理作用研究进展J黑龙江药,2010,230223423615闵巍巍，张作法黄酮类化合物的药理作用J蚕桑通报，2007，38（04）1316刘金旗，王兰，刘劲松，等菊花叶黄酮类化合物的实验分析J中国中医药科技，2002，9（4）22617张健,李友宾,钱大玮,等菊花化学成分及药理作用研究进展J18于鲁