水平传染的克隆癌细胞在软壳蛤种群中引发了癌症

水平传染的克隆癌细胞在软壳蛤种群中引发了癌症摘要遍及全世界的癌症的爆发使得海生双壳类动物数量大量减少，这种癌症和白血病类似且极为致命。这种疾病的诱因尚不清楚。我们最近发现了一个反转录转座子，称为“STEAMER”，这个转座子在软壳蛤（砂海螂）的癌细胞中被大量表达和放大达到了高拷贝数。通过对STEAMER整合位点，线粒体DNA单核苷酸多态性，以及多态性微卫星等位基因的分析，我们得到的结果是癌细胞的基因型和宿主细胞的基因型不匹配。相反，从纽约，缅因州，爱德华王子岛和加拿大等不同地方获得的癌细胞都有几乎相同的基因型，并且这些癌细胞的基因型都与它们的宿主不同。这些结果表明，这种癌症以一个克隆的可传染细胞的方式在海洋环境中的动物之间传播。而这些癌细胞全部来自于一个原发此病的蛤个体。我们的研究结果表明，癌细胞的水平传染事实上比我们以前认为的更为普遍。引言癌症通常都是生物体存活时体细胞的突变不断积累并组成了一个可以克隆扩增的转化细胞的结果。这个转化细胞的基因型衍生于宿主。受到免疫识别和基于多态表面蛋白的排斥，特别是脊椎动物中的主要组织相容性复合体的限制，癌症通常不会传染或者转移至另一个体。一些肿瘤是由像病毒这样的传染性病原体引起的，虽然这些病原体可以是具有传染性的，但是肿瘤还是会以转化体细胞的方式出现在每一个被感染的个体中。有两例已知的类似肿瘤，在这两例中，一个肿瘤细胞作为一个传染性细胞系在个体之间自然传播。它们是犬传染性性病肿瘤，通过性接触传播，以及袋獾面部肿瘤，在个体间通过咬传播。在这两例中，肿瘤表现出的基因型也和他们的宿主不匹配。相反，在所有受影响的动物中发现的肿瘤细胞都是一个独特基因型的单一克隆，这种基因型反映出了它最初最原始的宿主。浸染型或者血型的肿瘤是发生在许多水生双壳类动物中的白血病型的癌症。这些水生双壳类包括蛤蚌，贻贝，鸟蛤，牡蛎，其特点是血淋巴中细胞的扩增，血淋巴是软体动物的循环液。这种疾病影响着北美东海岸的软壳蛤，20世纪70年代首次记载了这个物种中的这种疾病。这种肿瘤血细胞具有独特的形态，它有新的表面抗原，胞质中存在错误定位的P53肿瘤抑制蛋白，失去了吞噬能力，大量增殖并进入组织传播。大部分的传播性双壳类肿瘤是非整倍体，他们的DNA含量高于正常。尽管个体间有变异，但基于DNA含量的流式细胞分析仪分析，根结线虫的瘤细胞大致是四倍体。这种疾病可以通过试验性的血细胞移植传染给幼年动物。有理由怀疑这种情况是病毒造成的，但没有任何传染性病原体被证实。对大多数受到影响的蛤来说，这种疾病是致命的，这也造成了北美东海岸该物种数量的下降。对肿瘤细胞中的逆转录酶活性检测表明了逆转录因子参与的可能性，我们利用高通量测序技术测序了蛤的CDNA并发现了一个以前未知的LTR反转录转座子，“STEAMER”，它的表达被发现与疾病密切相关。在正常的蛤中，基因组内包含2到10个内源性的反转录转座子“STEAMER”的拷贝（标准化成为一个单拷贝基因），但是在肿瘤细胞中，“STEAMER”DNA的复制数被大幅放大到了150到300个拷贝数。在多个白血病动物的肿瘤细胞中发现了几个共同的“STEAMER”整合位点，这促使了对这种癌症进一步的遗传学调查。这里，我们首先扩大观察范围并发现肿瘤细胞中共同含有的“STEAMER”整合位点并不存在于正常动物或者患病动物的正常组织中。这样的结果有两个可能的解释要么“STEAMER”反转录转座子在这些肿瘤中的特异性结合位点表现出了前所未有的选择性，或者这些肿瘤并不是独立出现的，而是都是一个带着这些公共“STEAMER”位点的原始的白血病细胞的后代，就像在狗和袋獾的传染性癌症中观察到的那样。因此，我们分析了线粒体DNA序列和多态微卫星重复序列，最终发现肿瘤细胞的基因型与他们的宿主并不匹配。此外，所有癌细胞的基因型彼此几乎相同，这明显说明了以传染性癌细胞的方式在大西洋海岸横向传播的软壳蛤白血病来自一个单一的克隆起源。结果在癌细胞中共同的“STEAMER”整合位点白血病动物的癌细胞“STEAMER”反转录转座子拷贝数很高，但是这种高拷贝数在正常细胞中并不存在。对患病动物不同组织的DNA分析表明“STEAMER”拷贝数在实体组织中低，而在血淋巴细胞中最高，所以一些实体组织中的拷贝数有所增加可能是由于血淋巴癌细胞的散播。微量的“STEAMER”整合位点初步序列分析表明，肿瘤细胞的DNA包括了在正常的蛤中不存在的新的整合位点，并且令人惊讶的是，这些新的拷贝往往被发现在不同白血病动物的相同位置。我们现在将这一分析扩展到纽约，缅因州，爱德华王子岛和加拿大的独立种群中的白血病动物。我们用反向PCR技术从多个白血病动物身上克隆出了“STEAMER”整合位点，并设计了诊断引物来扩增出每个特异性结合位点。利用这些引物进行的PCR测试使得我们能量化肿瘤和组织中的每个插入位点的存在。在12个插入位点的测试中，7个出现在了从所有地理位置搜集来的肿瘤DNA样本中，4个在缅因州和纽约的肿瘤组织中共有，而这4个不存在于加拿大的肿瘤样本中，还有1个位点在加拿大的肿瘤样本中是独有的。这些癌症特有的结合位点并没有在任何健康动物中被发现，并且在白血病动物的正常组织中也只检测到了微量存在，很可能是由肿瘤细胞浸润到正常组织形成的。肿瘤细胞中相同的线粒体DNA多态性对共同结合位点观察提出了所有肿瘤来自同一个克隆起源的可能性。为了检验这一假设，即软壳蛤的白血病通过自我克隆的传染性癌细胞在动物之间水平传播，我们检测了白血病蛤和正常蛤的DNA单核苷酸多态性，我们的检测是通过检测线粒体中编码细胞色素C氧化亚基和细胞色素B的基因序列完成的。所有健康动物（N11）和白血病动物的正常组织中的DNA的细胞色素B基因中都有一个共同的等位基因（C685），而所有的白血病动物的肿瘤血细胞（N9）的DNA都携带了一个独特的单核苷酸序列（C685T）。这一观察结果支持这个假说，即肿瘤细胞在动物之间以含有这种独特单核苷酸序列的同种异体移植物的形式传播。另一个单核苷酸序列（细胞色素C氧化亚基中的G649A）在4个来自爱德华王子岛的白血病动物的血细胞DNA中被发现，但是这一序列在没有在其他地方被找到，也不在以前发现的27个根结线虫的细胞色素C氧化亚基的等位基因中，这表明这个突变发生在这个种群的感染性细胞的进化过程中。此外，7个低频的线粒体DNA单核苷酸序列也被发现。这些序列存在于正常动物和白血病动物的正常组织中。我们在白血病动物的正常组织的DNA中发现了四个罕见的单核苷酸序列的信号位点，但是在肿瘤血细胞的DNA中并不包含相匹配的组织等位基因，相反，它们有一个所有肿瘤细胞共有的等位基因。这些数据表明，白血病不是从他们的宿主中产生的，而是和克隆传播的肿瘤一致。微卫星基因型确认了蛤白血病的克隆起源为了更详细地描述肿瘤细胞的基因型，我们通过PCR技术分析了核DNA先前被确定在根结线虫内的DNA多态性的10个微卫星位点，这些位点在个体之间具有高度的一致性，甚至很多动物在这一位点是杂合子，即有两种PCR反应产物。在正常的动物中，血细胞DNA中存在的等位基因总是能和宿主组织DNA相匹配。而恰恰相反的是，在所有的白血病动物中，微卫星基因型都与宿主动物组织截然不同。此外，几乎在每一个位点，所有白血病动物的肿瘤血细胞中的微卫星等位基因都有相同的长度。也就是说，所有肿瘤的基因型都和彼此相同。接下来，我们又用了荧光标记的引物以一个碱基的分辨率来区分微卫星PCR产物的大小。虽然所有的正常动物在每个位点都有一个等位基因（纯合子）或两个等位基因（杂合子），但对白血病DNA的微卫星尺寸分析显示在某些位点至多有4个独立的等位基因。大部分白血病的等位基因在独立的肿瘤之间是相同的，但在副本的的大小上也有一些细微变化，以及我们发现了几例白血病个体中的等位基因的丢失和获得的案例。我们使用了基于模型的聚类程序结构来分析微卫星等位基因的大小，不论使用多少组别数量，肿瘤血细胞的基因型总是和正常动物的基因型不同，而白血病动物的正常组织的基因型却与正常动物相同。我们以个体间的基因差别为基础建立起了一个邻接树，这清楚地表示出了肿瘤血细胞的基因型作为一个独立的分组，与所有正常的基因型及来自宿主的正常组织的基因型完全不同。在肿瘤谱系中有两个分支，这表明了现存的白血病细胞起源于一个共同的祖先并分化成了爱德华王子岛和美国发现的那两种亚种。分析三个数据集（STEAMER结合位点，线粒体DNA单核苷酸多态性，和微卫星等位基因）表明，肿瘤细胞的基因型与他们宿主细胞的基因型不同但是他们彼此之间相同或密切相关。我们认为个体的白血病细胞不是由独立的每个宿主的细胞的致癌性转化形成，而是由一个在基因上没有关联的父本传染而来。这些数据有力证明了传染性癌症是以传染性癌细胞的方式自然地在动物之间传播的。水平克隆传播的癌症只在两种其它的野生哺乳动物中被观察到，即犬传染性性病肿瘤和袋獾面部肿瘤。相距数百英里的蛤床中提取到的癌细胞在基因上几乎相同或密切相关是十分惹人注意的。软壳蛤的白血病细胞系可以在自然界中的动物之间传播的机制尚不明确。在先前的两例自然癌细胞传染中，身体接触（通过咬或者性接触）是癌细胞传染到新动物的必要条件，但是成年蛤的身体是固着的，他们通常不会互相接触。蛤过滤海水进食，因此提高了白血病通过被肿瘤细胞污染的海水传染的可能性。每个动物每小时可以过滤几升的海水，所以海水中可以用来传播的细胞很少。一个早期的研究表明白血病蛤的血细胞可以在自然海水环境中存活超过6小时而几乎不发生细胞死亡，这提出了癌细胞从一个蛤传染到另一个蛤的一个可能的路径。对受影响的蛤床附近的海水中对癌细胞的直接调查可以为这一想法提供支持。目前还不知道白血病动物如何释放肿瘤细胞。肿瘤细胞可能在疾病过程中自然脱落，可能在增殖过程中或身体受到创伤后释放，也可能在捕食过程中或者白血病个体死亡后释放。在自然界中肿瘤的哪一个发展阶段最容易传染并不清楚，但是在实验室中，成熟动物的肿瘤中期被发现最易传染。很可能人工干预加速了它的传播，因为最近几十年里，在几个海岸点的种子细胞已经被移植了多次。原始的软壳蛤肿瘤细胞的形成时间现在还不清楚。在20世纪70年代在软壳蛤种群中就有了此种疾病的记载，并且所有的病例可能都是来自一个相同的克隆，这表明它可能至少有40年甚至更长的历史。它过去出现的时间一定足够远，这样它才会广泛地分布在北大西洋沿岸。在美国和加拿大蛤种群的癌细胞亚群中发现了显著的差异。几个细微的微卫星基因的添加和缺失以及至少一个线粒体DNA单核苷酸多态性好像在爱德华王子岛的癌细胞亚群中是独立的。对这些癌细胞的起源和进一步演化的分析可能允许我们估计最初的白血病细胞的出现时间。另外两种传染性肿瘤的例子有着十分不同的历史；狗肿瘤被认为是出现在10000到13000年前左右，而袋獾肿瘤有着很近的起源，可能起源于20到30年前。“STEAMER”反转录转座子在传染性肿瘤的发展中发挥着作用是合理的。“STEAMER”基因的拷贝数在癌细胞中猛增（在单倍体基因组中从2到10个拷贝数变到150到300个拷贝数），我们证明了大部分新的整合位点在所有检测的肿瘤细胞中是相同的，因此这些整合位点的出现可能发生在肿瘤的早期演化过程中。一个或多个这些共同的整合位点突变事件可能直接导致了最初的癌变，就像所有犬传染性性病肿瘤都有临近CMYC基因的LINE1整合位点突变一样，但是他们也可能只是被固定在白血病基因组的偶发突变。一些整合位点是爱德华王子岛或美国的癌细胞亚群所特有的，这些可能表现了逆转录转座得到的新拷贝或是是由于重组或异倍体性导致的拷贝丢失；这些位点不太可能是肿瘤的起因。进一步的分析对癌细胞和正常血细胞的基因组和表达谱进行了比较，这个分析可以给我们找到表型转变的原因提供线索。尽管我们检测的所有根结线虫癌细胞都来自同一个细胞系，其它的白血病细胞细胞可能来自不同的克隆或更传统的机制。白血病可以通过给蛤注射5溴脱氧尿嘧啶核苷注射液诱导，然而这些病例必须通过宿主细胞的从头转化或是可能通过“STEAMER”换位现象出现。也有报道说蛤白血病可以通过过滤器在动物之间传播，但这是有争议的。传染性的肿瘤也被报道在其他双壳类中出现，包括其它蛤，牡蛎，贻贝和鸟蛤，这些疾病也可能是由克隆传播的癌细胞引起的。最近的一份报告说北美西海岸的贻贝中的肿瘤血细胞在P53基因处有一个共同的单核苷酸多态性序列，这个序列与该物种的传染性克隆癌细胞有独立发展的一致性。对许多双壳类生物的弥散性肿瘤的DNA内容进行流式细胞检测已经确定了特征性的倍性水平确实，多倍性已经作为诊断疾病的依据了。就根结线虫具体而言，观察到大致的四倍体DNA含量以及肿瘤细胞中同一位点至多四个独特的微卫星等位基因和克隆性传染癌细胞一致。鉴于目前的研究结果，以前观察到的双壳类散播性肿瘤的异倍体表明许多其他物种中的这些疾病可能代表独立的传染性肿瘤谱系。例如，贻贝散播性肿瘤已被报道有两种类型，四倍体和五倍体，这样的结果与两个独立的肿瘤谱系或者一个已经进化成不同倍性亚型的肿瘤谱系一致，但是最近的一项研究发现了个体之间广泛存在的非整倍体性。在对鸟蛤的散播性肿瘤的观察中也观察了多异倍体水平。我们现在正在研究的假说是通过现有的发现认为在其它双壳类的传播性癌症代表了独立的传染性肿瘤谱系。对患有散播性癌症的鸟蛤的初步线粒体DNA测序表明有一个鸟蛤衍生的传染性癌细胞谱系（数据未显示）。很可能根结线虫的散播性癌症可以传染给其他物种，尽管现在还没有证据证明这一点。宿主动物中可能存在一种可以拒绝其它物种的